Тема 9. Хімічні та ензиматичні методи вивчення структури та функціональних особливостей нуклеїнових кислот Синтез та гідроліз

Синтез ДНК та РНК. Хімічний синтез ДНК та РНК, як правило, здійснюється на комерційних приладах з використанням фосфорамідиту на твердій основі. До 3’-положення цукру приєднують реактивну фосфорамідитну групу – тривалентний фосфор з двома ефірами та амідним зв’язком:

Тривалентний атом фосфору у ході синтезу повністю окислюється до п’ятивалентного стану, що і знаходиться у природніх НК.

Синтез (слайд 2) починається з приєднання 3’-термінального мономеру до силікатної основи з вільною для проведення реакції 5’-кінцевою гідроксильною групою. Одначе, для виключення вступу у реакцію інших груп мономеру, аміногрупа в азотистій основі, якщо перша присутня, є захищеною і 2’-гідроксильна група рибози у випадку синтезу РНК також є закритою. Наступний мономер з приєднаною 3’-фосфорамідитною групою, який також має захищеними ті ж групи що й у першому мономері, додається до середовища таким чином, щоб його фосфорамідитна група приєдналась до вільного 5’-кінця першого нуклеотиду з утворенням фосфатного диефіру. Далі фосфор окислюється до п’ятивалентного стану для формування нормального фосфатного ефіру. Подальші мономеру додаються таким же чином. Після приєднання останнього нуклеотиду (на 5’-кінці) молекула олігонуклеотиду від’єднується від силікатної основи, захисні групи знімаються, та сама молекула очищується. Таким чином можна синтезувати ДНК довжиною до 150 пар основ у кількості до декількох мікрограм. Причому ДНК синтезується легше, оскільки в ДНК відсутня 2’-гідроксильна група, яку треба спеціально захищати. Реакція незахищеної 2’-групи може призвести до появи 2’-5’-фосфатних диефірних зв’язків або навіть розгалужених ланцюгів РНК.

Основною перевагою хімічного синтезу НК є можливість включати у їх склад неспецифічних або радіоактивно мічених нуклеотидів.

Ензиматичний синтез РНК достатньо ефективно здійснюється за допомогою РНК-полімерази бактеріофага Т7 та хімічно синтезованої ДНК-матриці. Матриці для довгих послідовностей РНК, як правило, отримують клонуванням меншої матриці та промотерного регіону. У такому випадку ДНК може бути транскрибованою РНК-полімеразами фагів Т7, Т3 або SP6.

Для інкорпорації модифікованих або мічених нуклеотидів у довгу послідовність РНК використовують комбінації ензиматичних та хімічних методів. Наприклад, хімічно синтезується короткий РНК-олігонуклеотид, який містить модифікований нуклеозид. Далі такий олігонуклеотид приєднується до довгої послідовності РНК з використанням ДНК-лігази Т4 (яка потребує подвійноланцюгового субстрату) та ДНК-матриці, що комплементарна до кінців РНК-молекул, які потрібно з’єднати.

Для ампліфікації потрібної послідовності ДНК може бути клонована та реплікована in vivo. Можливою є також ампліфікація in vitro з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), у якій використовується термостабільна ДНК-полімераза для напрацювання великої кількості копій ДНК. Причому для визначення того, який саме регіон дуплексу піддається ампліфікації, використовують одразу два олігонуклеотидні праймери. Після кожного циклу синтеза середовище нагрівають для дисоціації ДНК-полімерази від новосинтезованого дуплексу та її переходу до нового циклу. Оскільки кожен цикл дає подвоєння молекул ДНК, даним методом можна швидко напрацювати потрібну кількість послідовностей.

Можливим є також варіант синтезу випадкових послідовностей, якщо тільки наступна стадія включає в себе високоспецифічний відбір молекул з потрібними властивостями. Наприклад, синтезуються всі можливі послідовності потрібної довжини з використанням чотирьох можливих фосфорамідитних похідних на кожному кроці синтезу. Потім проводиться процедура селекції для відокремлення невеликої кількості молекул з потрібними властивостями. Наприклад, Терк та Голд у 1990 році синтезували всі можливі 65536 шпильок РНК з петлями у вісім нуклеотидів на однаковому стеблі. Селекція проводилась за допомогою приєднання до шпильок ДНК-полімерази Т4. Найбільш міцно приєднана фракція була ампліфікована за допомогою ПЛР після того, як РНК була зворотно транскрибована на ДНК. Такі послідовності були знову обрані як ті, що найміцніше зв’язані з полімеразою. Після декількох циклів селекції та ампліфікації залишилась лише невелика частина різних варіантів послідовностей петлі. Використання саме восьми нуклеотидів у шпильці диктувалося тим, що приєднання Т4 ДНК-полімерази до матричної РНК здійснюється через взаємодію ферменту саме з восьминуклеотидною шпилькою у складі мРНК. Таким чином, селекція дозволила не лише знайти природну послідовність шпильки, а також виявити існування квадриплексного мутанта, який також приєднувався досить міцно до ДНК-полімерази.

Подібною методикою, яка називається скорочено SELEX, можна отримати практично всі види коротких олігонуклеотидів, але для полінуклеотидів існує проблема, коли діапазон усіх можливих послідовностей стає недосяжним через потрібну велику кількість напрацьованого матеріалу. Наприклад, полінуклеотид з 50 нуклеотидів може дати 4⁵⁰ видів різних послідовностей, що складає близько 10³⁰ різних молекул. Така кількість ДНК або РНК матиме молекулярну масу у два мільйони моль, а важити такі молекули будуть біля 30 мільйонів кілограм. Для порівняння – мікромолярні кількості невеликих олігонуклеотидів містять «всього» 6 10¹⁷ молекул. Таким чином, для такого методу підходять лише полінуклеотиди з кількістю мономерів максимум до 30. У всіх інших випадках за допомогою SELEX розглядають лише незначну частину можливих видів послідовностей, одначе й такі результати допомогли виявити незвичайні каталітичні активності та види взаємодій між послідовностями ДНК та РНК.

У процесі синтезу, хімічного чи ферментативного важливою є також можливість взаємоперетворювати нуклеотиди та нуклеозиди.

1. Нуклеозиди обох типів можуть фосфорилюватися до 5’-фосфатів, 5’-дифосфатів та 5’-трифосфатів з використанням відповідних кіназ, які каталізують перенесення фосфатної групи з АТФ на відповідний нуклеотид.

2. Від’єднання фосфору від нуклеотидів можливе за допомогою використання фосфатаз (фосфомоноестераз), причому нуклеотиди можуть перетворюватись на відповідні нуклеозиди.

3. Гідроліз 2’-3’-циклічних фосфатів у складі нуклеотидів здійснюється за допомогою фосфодиестераз, оскільки фосфатази не атакують такі зв’язки.

4. Для введення у 5’-кінець полінуклеотиду міченого фосфору часто використовують комбінацію двох ферментів: фосфатази (для від’єднання нормального фосфату) та кінази (для приєднання ³²Р).

Гідроліз ДНК та РНК. Як створення, так і розрив зв’язків між нуклеотидами є важливим для синтезу та сиквенсу НК. Також це допомагає вивчати механізми процесінгу РНК, рибозимів, та дію РНКаз та ДНКаз.

Загальні механізми гідролізу 3’-5’-фосфодиефірного зв’язку представлено на слайдах 3 (для РНК) та 4 (для обох видів НК). Фосфор у складі фосфатної групи нуклеотиду у нормальному стані знаходиться якраз у центрі тетраедра з чотирьох атомів кисню, але у випадку перехідного стану до гідролізу він переміщується у центр тригональної подвійної піраміди з атакуючим центром у п’ятому сайті. Та група, яка полишає комплекс, знаходиться на лінії з з фосфором та атакуючою групою, таким чином, спостерігається лінійне розташування основних груп. В РНК атакуючою групою часто є 2’-гідроксил рибози, такий гідроліз призводить до 2’-3’-циклічних фосфатних форм нуклеотидів, хоча потім такий цикл відкривається за допомогою води з вивільненням 2’- або 3’-фосфатів. Подібна атака за допомогою 2’-гідроксилу рибози залучена до механізму каналізованого гідроксид-йоном гідролізу РНК та є типовою для більшості рибонуклеаз. Наприклад, автокаталітичні рибозими «хаммерхед» у якості продуктів реакції залишають 2’-3’-циклічні фосфати. На слайді 3 представлена основа, позначена літерою В, яка відбирає атом водню від гідроксилу у 2’-положенні. Такою основою може бути група ОН^- або бічний радикал ферменту. Реакція також може прискорюватися за допомогою кислотного каталізу (НА) у місці розміщення кисню, також за допомогою йонів металів або будь-якого позитивного заряду, які здатні нейтралізувати негативний заряд фосфату у перехідному стані. Такий механізм припускає інверсію конфігурації зв’язків біля атома фосфору у процесі гідролізу. Така інверсія була спостережена з використанням хіральної фосфатної групи у реакції гідролізу за допомогою заміщення одного з атомів кисню біля фосфору кисневим ізотопом або атомом сірки.

Схожий тип механізму гідролізу, але з використанням атаки екзогенної гідроксильної групи (слайд 4), може призвести до появи 5’-фосфату та 3’-вільного гідроксилу. Така реакція характерна як для ДНК (у більшості випадків), так і для РНК. Рибозим з Tetrahymena, який каталітично розщеплює сам себе та інші молекули РНК, використовує екзогенний гуанозин, як постачальник атакуючого гідроксилу та вивільнює 5’-фосфати (з інвертованою конфігурацією) та нуклеотиди з вільними 3’-гідроксильними групами.

Взагалі, ДНКази після своєї дії залишають лише 5’- або 3’-фосфати, в той час як РНКази дають циклічні 2’-3’-фосфати, які повільно відкриваються з формуванням рівних кількостей 2’- та 3’-фосфатів. У таблиці на слайді 5 представлені найбільш розповсюджені у експериментальних дослідженнях види нуклеаз. Про самі нуклеази ми поговоримо детальніше дещо пізніше.

Використання рестрикційних ферментів. Рестрикційними ферментами називають ендонуклеази, що розщеплюють подвійні ланцюги ДНК суворо за місцем специфічних сайтів, які називаються сайтами рестрикції. Використання рестриктаз призвело до багатьох відкриттів у сфері молекулярної біології. Насьогодні відомо близько 250 рестриктаз.

Сайти рестрикції представляють собою, як правило, паліндроми, тобто короткі самокомплементарні послідовності (слайд 6). Довжини таких послідовностей можуть варіювати з 4 до 8 нуклеотидів. Чим довшою є така послідовність, тим менше розрізів в ДНК здійснює фермент. Наприклад, рестриктаза, специфічна до послідовності у 8 нуклеотидів, здійснює один розріз на кожні 65536 пар основ.

Для полегшення маппінгу геномної ДНК ідеальними були б ферменти, які різали б ДНК всього у декількох місцях на геном. Тому були спроби збільшити величину впізнавальної послідовності, а отже, зменшити кількість розрізів експериментально за допомогою мутацій або хімічних модифікацій ферментів.

Альтернативним методом зменшення точок розщеплення ДНК рестриктазою може слугувати використання специфічного білку (такого як lac-репресор) для його зв’язування з ДНК та розпізнавання послідовностей від 10 до 20 нуклеотидів. Такий репресор захищає нуклеотиди у сайті зв’язування від метилування метилтрансферазами. Оскільки рестриктази не розрізають сайти метилування, всі сайти рестрикції, не захищені репресором, стають блокованими для дії рестриктаз. Коли репресор від’єднується від послідовності, вона залишається єдиною доступною для розщеплення; таким чином специфічний розріз виникає раз на 10⁶-10¹² пар нуклеотидів.

Ще одним методом, описаним Дерваном у 1992 році, є метод, що базується на формування потрійних ланцюгів для специфічного розщеплення ДНК на ділянки у декілька мільйонів пар основ.

Рестрикційні ендонуклеази можуть формувати «тупі» кінці розщепленої ДНК шляхом суворо-симетричного розщеплення у обох площинах паліндрому, або можуть продукувати «липкі» кінці розщепленням у сайтах, симетричних не вздовж, а лише поперек ланцюгів паліндрому. Таким чином, «липкі» кінці можуть мати неспарені одноланцюгові 5’- або 3’-кінці. Зрозуміло, що саме другий тип кінців є важливим для конструювання різноманітних векторів та інших конструктів молекулярної біології. Нарешті, деякі з рестриктаз залишають термінальні 5’-фосфати, інші – 3’-фосфати.