Особливості будови тРнк

Вперше первинна структура тРНК була визначена у 1964 році, і одразу ж з’явилися передумови для визначення її вторинної структури, яка наразі відома під назвою «листка конюшини» (слайд 20а та b). Така структура є результатом формування водневих зв’язків між віддаленими регіонами РНК, що призводить до набору подвійно ланцюгових ділянок, що чергуються з одно ланцюговими петлями. Таким чином, у структурі тРНК виділяють наступні елементи:

1. Акцепторне стебло/«рука»,

2. Антикодонове стебло/«рука»,

3. D-стебло або дигідродуридинове стебло/«рука»,

4. Т(ψ)-стебло або псевдоуридинове стебло/«рука»,

5. Антикодонова петля,

6. Дигідроуридинова петля,

7. Псевдоуридинова петля,

8. Варіабельна або додаткова петля.

Всі види тРНК містять цілий ряд модифікованих нуклеозидів, серед яких можна назвати, наприклад, N2-диметилгуанозин, N1-метиладенозин, псевдоуридин (позначається як ψ; ізомер уридину, у якому глікозидний зв’язок між рибозою та урацилом йде від С5-атома основи, а не від N1, як у нормальному нуклеозиді), дигідроуридин (D). Всі тРНК мають від 70 до 95 нуклеотидів, точна кількість залежить від числа нуклеотидів, що формують варіабельну петлю.

Кристалічна структура тРНК, а саме фенілаланін-тРНК була вперше отримана незалежно лабораторіями Робертуса та Кіма у 1974 році. Після того за 20 років було отримано не так уже й багато кристалічних молекул тРНК, які представлені у таблиці на слайді 19 внизу.

Робертус та Кім показали, що молекула тРНК має третинну структуру у формі літери L, причому на кожну перетинку літери потрапляє по 2 «руки», дві ці пари розташовані під прямим кутом одна відносно одної. Конформація листка конюшини при цьому зберігається, але додаються зв’язки між віддаленими регіонами молекули, які показані на слайді 21.

Самі стебла мають у своїй основі хелікси А-РНК, а тримають їх попарно вже виявлені нами зв’язки між основами, у результаті формується третинна структура тРНК (слайд 22). Причому довша антикодонова «рука» накладається у пару з коротким хеліксом D-стебла – перша перекладина, в той час як друга, їй перпендикулярна, сформована хеліксом акцепторного стебла, поєднаним з Т-стеблом, яке має лише чотири пари основ.

Основні зв’язки між основами у кількості дев’яти, які тримають структуру у L-формі, знаходяться у районі «коліна» літери, у місці приєднання двох пар «рук». Майже всі з них є некласичними комплементарними парами, а деякі - навіть триплетними (слайд 23). Пізніше ми побачимо, що такі триплети основ є аналогічними знайденим у структурі ДНК.

Наразі одним з найновіших досліджень структури тРНК є проведена Ші та Муром у 2000 році за 1,93-2,0 А на швидко-заморожених кристалах. Були виявлені нові сайти приєднання для йонів магнію, а також додаткові водневі зв’язки основ з водою.

Рибозими – ферменти на основі рнк

Здатність певних РНК-молекул до каталітичного розщеплення самих себе або інших молекул РНК, була доведена для наступних категорій РНК:

1. Аутосплайсингова група І інтронів РНК – це перша відкрита група рибозимів, отримана з Tetrahymena та охарактеризована Чехом, Зангом та Градовськи у 1981 році. Такі елементи містять чотири консервативних послідовності та формують характеристичну вторинну структуру. Гідроліз починається з нуклеофільної атаки з боку гуанозинового залишку у складі консервативної послідовності.

2. Аутосплайсингова група ІІ інтронів РНК – також має консервативні елементи послідовності, але зовсім іншу вторинну структуру та змінений механізм каталізу, який включає нуклеофільну атаку аденозину, що розташований всередині консервативної послідовності інтрону.

3. РНК-ова частина ферменту РНК-ази Р.

4. Аутогідролізні ділянки сателітних РНК вірусів та рослин. Вони є меншими, ніж групи інтронів І та ІІ, та включають в себе відомий рибозим хаммерхед, про який ми поговоримо детальніше (слайд 24).

5. Рибосомальна РНК (рРНК) у складі димерного рибонуклеопротеїдного білок-синтезуючого комплексу (рибосоми), а саме – пептидил-трансферазний домен.

Хаммерхед. Вперше цей незвичайний рибозим був виявлений двома незалежними групами вчених – Плеєм, Флаєрті та МакКеєм у 1994-му році, та Скоттом, Фінчем та Клагом у 1995-му. Одна з даних структур (отримана раніше) мала у своєму складі ДНК-ланцюг з так званим «уявним» сайтом розщеплення. Оскільки рибозими не здатні розщеплювати ДНК, така послідовність відіграє роль ефективного інгібітора, тому був отриманий інгібіторний комплекс рибозиму.

Інша структура хаммерхеда, отримана у 1995 році, взагалі не мала ДНК-ової частини та у активному сайті містила цитидин з метильною групою у 2’-О-положенні замість гідроксильної. Взагалі ж дані структури мали вигляд трьох подвійних А-РНК-стебел з центральним двох-доменним регіоном, що містив консервативні послідовності основ (слайд 24). Таким чином, структура хаммерхеда нагадує двозубу вилочку.

Послідовність з двох нуклеотидів ЦА у складі рибозиму є сайтом аутокаталітичного розщеплення та розташована на верхівці двох стебел, що пересікаються під прямим кутом (слайд 24), у місці різкого повороту кістяка, якраз навпроти уридину у першому домені, який сформований консервативною тетрануклеотидною послідовністю CUGA. Така U-подібна конформація є схожою на конфігурацію антикодонової та псевдоуридинової петель тРНК.

Другий домен хаммерхеда розташований навпроти першого, на з’єднанні двох стебел та містить скорочений тандем некласичних пуринових пар А-Г. Цей домен потрібен для підтримання правильного розташування каталітичного домену (першого) по відношенню до субстрату, тобто іншої прилеглої ділянки самого рибозиму.

Загальний механізм каталізу хаммерхеда включає у себе нуклеофільну атаку з боку 2’-ОН-групи цитозину на атом фосфору найближчого прилеглого фосфодиефірного зв’язку у цукровофосфатному кістяку (слайд 25). Було також виявлено, що у даному процесі важливу роль відіграють йони металів, а саме –магній. Цей йон розташовується близько до неканонічних пар А-Г, що дозволяє припустити роль магнію у якості стабілізуючого фактора конформації, потрібної для каталізу.

Гіпотеза, висловлена Ліллі у 1999 році, передбачає більш безпосередню участь йонів магнію у процесі каталізу. Виявилося, що дані йони розташовані у декількох варіабельних позиціях всередині активного сайту. Це дозволяє припустити, що магній відіграє роль допоміжного йону у русі електронів, можливо, через стабілізацію груп розщеплюючих груп.

У ході досліджень, проведених Фейгом, Скоттом та Уленбеком у 1998 році, виявилося, що йони тербію здатні інгібувати каталітичне розщеплення рибо зиму, а структура тербійного комплексу показує, що йон локалізований близько до залишків G5 та А6, а не у самому активному сайті, як у випадку магнію. Мюрреєм у 2000 році була виявлена структура інтермедіата каталітичного процесу, який показав значні конформаційні зміни у процесі реакції, які призвели до значного наближення активного сайту рибо зиму до димеру G5/A6, що, разом з даними про інгібуючу роль тербію, свідчить на користь залучення даного димеру до каталітичного процесу.

Складні рибозими. Їх вивчення, як уже згадувалося, почалося у 1996 році з кристалізації рибозимного домену групи інтронів І, який відповідає домену Р4-Р6 інтрону Tetrahymena. Такий домен має у своєму складі 10 хеліксів, що тримаються разом завдяки проникаючим петлям та сполученням, з каталітичним сайтом, що є наближеним до одного псевдовузлового та двох сполучних регіонів, як було показано Віценсом та Чехом у 2005 році.

Сама структура інтрону Tetrahymena (слайд 25) складається з 160 нуклеотидів та має вигляд двох приблизно колінеарних хеліксних регіонів. Всередині їх існує певна кількість унікальних ділянок РНК, а саме:

1. Збагачена аденозином опуклість,

2. Триланцюгове сполучення,

3. Тетра-петля будови GAAA.

Близьке пакування хеліксів РНК у даній та інших структурах великих рибозимів можливе завдяки сприятливим взаємодіям між неспареними аденозинами, що приєднані одночасно до одного з хеліксів та до малої борозенки прилеглого до нього, але розміщуються назовні хеліксу. Саме тому у структурі багатьох великих складних рибозимів даного типу виявляється велика кількість консервативних неспарених залишків аденозину.

Додатковими варіантами складних рибозимів, що здатні каталізувати розщеплення РНК, є ділянки геному віруса гепатиту дельта та так званий шпильковий рибозим:

1. Вірус гепатиту дельта має дуже складні ділянки РНК-геному, що утворені п’ятьма хеліксними регіонами, які разом складаються у подвійну псевдовузлову структуру (слайд 26). Сама псевдовузлова ділянка являє собою повторюваний регіон РНК, який включає у себе одноланцюговий регіон та петлю, що взаємодіють між собою за допомогою водневих зв’язків, утворених між двома хеліксами (слайд 26). Така будова є унікальною навіть для рибозимів, оскільки активний сайт у даному випадку знаходиться глибоко всередині п’ятихеліксного кору (слайд 27).

2. Шпильковий рибозим є ще одним прикладом доволі складного РНК-комплексу, та за властивостями дуже схожий на ферменти, що використовують активовані фосфатні групи, наприклад, рибонуклеазу. Шпильковий рибозим складається з чотирьох-стволового сполучення, яке формує центр структури, причому його індивідуальні хелікси насьогодні вивчені недостатньо, хоча виявлено, що у процесі вбудовування таких ділянок у зрілий рибозим, вони зазнають значних конформаційних перебудов.

У таблиці на слайді 28 представлено дані щодо кристалізованих на даний час форм рибозимів.