Інші типи днк-розпізнавальних білкових структурних елементів

Серед таких ділянок ДНК-розпізнаючих білків, які приєднуються у районі великої борозенки ДНК, можна відмітити наступні:

1. «Лейциновий зіппер» - зустрічається у складі багатьох еукаріотичних транскрипційних факторів, одночасно є димеризуючим елементом, вперше був знайдений Елленбергером у 1992 році у складі транскрипційного фактора GCN4 з дріжджів. Такий «зіппер» складається з дуже довгого та майже прямого α-хеліксу, що містить регулярно-повторювані залишки лейцину (слайд 11). Два таких хелікс взаємодіють між собою та формують структуру паралельно закрученої нитки. Така структура має у своїй основі велику кількість як прямих взаємодій з основами через бічні ланцюги АК, так і з кістяком ДНК через через непрямі варіанти зчитування. Причому для здійснення даних контактів критичним є положення α-хеліксу білку всередині великої борозенки ДНК – він повинен бути розміщений майже перпендикулярно до фосфодиефірного кістяку ДНК.

2. ДНК-зв’язуюча ділянка транскрипційного фактора Е2 з віруса папіломи, відкрита Хеджем з колегами у 1992 році. Являє собою антипаралельне β-барильце з парою α-хеліксів, які розміщуються у великій борозенці. Контакти між ДНК та білком у цьому випадку включають у себе прямі взаємодії між бічними ланцюгами АК та основами, а також непрямі взаємодії з боку білку з кістяком ДНК. Унікальною особливістю даного комплексу є формування невеликого закручення ДНК навколо β-барильця, причому кут радіусу згину дорівнює приблизно 45⁰. Це вдвічі менше, ніж спостережене закручування ДНК з кутом радіусу у 90⁰, що виявлене у САР-комплексах (транскрипційний активаторний білок) за участю димерних НТН-доменів Е.coli. Такий згин формується через велику кількість взаємодій з фосфатними групами ДНК, що призначені для правильного розміщення розпізнавального хеліксу у великій борозенці (слайд 12).

3. Нехеліксна розпізнавальна ділянка бактеріальних репресорних білків, що була відкрита у складі комплексу репресор/оператор met J Сомерсом та Філіпсом у 1992 році. У даному випадку у якості розпізнаючого елементу, зв’язаного з великою борозенкою ДНК, виступають подвійноланцюгові антипаралельні β-стрічки. Бічні ланцюги АК у складі стрічок непрямо та прямо взаємодіють з фосфатами та основами ДНК відповідно, причому прямий тип зчитування залишається таким же, як і у інших білків, розглянутих вище. Подібний варіант впізнаючої ділянки був знайдений також у цілій низці білків репарації ДНК.

Варіанти отриманих насьогодні кристалічних комплексів, що містять у білковій частині специфічні до великої борозенки ділянки, розглянуті вище, зведені у таблицю на слайді 12.

Розпізнавання днк білками у регіоні малої борозенки

Особливості розпізнавання В-ДНК. Оскільки основним регіоном взаємодії ДНК з білками вважається саме велика борозенка через свій вищий інформаційний потенціал, а також через те, що білкові розпізнавальні ділянки краще входять саме до неї, довгий час вважалося, що мала борозенка ДНК не відіграє будь-якої важливої ролі у взаємодії зі специфічними до послідовності білками та розпізнавання.

Одначе, пізніше було відкрито структури комплексів ДНК з білками, де взаємодії компонентів у регіоні малої борозенки мали важливу функцію стабілізації комплексу, такі структури, отримані насьогодні у кристалічному вигляді, подані у таблиці на слайді 13. Факти на користь такої можливості:

1. Бічні ланцюги аргініну у складі репресора 434 поєднані водневими зв’язками з основами та фосфатними групами ДНК через молекули води саме у регіоні малої борозенки.

2. Гомодоменні структури, які ми вже розглядали, мають подовжені N-кінцеві ділянки у вигляді «рук», які лежать у малій борозенці ДНК та тримаються там завдяки численним контактам між бічними ланцюгами АК та основами або кістяком ДНК у регіоні операторної послідовності, багатої на пари А-Т.

3. Водневі зв’язки залишків аргініну з атомами О2 тимінових основ у вищенаведених комплексах є аналогічними до тих, які утворюються завдяки приєднанню до малої борозенки ДНК синтетичних речовин.

4. Формування Ван-дер-Ваальсових взаємодій між основами та АК білків можливе в основному у районі малої борозенки у регіонах А-Т пар через меншу ширину останньої.

5. N-кінцеві ділянки білків, які містять у собі повторювану послідовність SRKK (серин-пролін-лізин/аргінін-лізин/аргінін), наприклад, N-кінці деяких гістонів, також приєднуються у регіонах малої борозенки, збагачених на А-Т пари.

Фермент Hin-рекомбіназа, що містить НТН-ділянку, як було виявлено з кристалографічних досліджень, своїм N-кінцем приєднується до А-Т збагаченого регіону ДНК з 14 пар основ саме у районі малої борозенки. У даному комплексі ДНК має В-форму та характеризується особливо вузькою малою борозенкою у регіоні А-Т пар (слайд 13). Також у даній структурі спостерігається низка специфічних унікальних контактів між АК та основами, наприклад, між аргініном та, одночасно, атомом N3 аденіну та атомом О2 тиміну.

Петлі білків також можуть приєднуватись до ДНК у регіоні малої борозенки, як було показано на прикладі репресорного Mu-комплексу білок-ДНК Войчеком зі співробітниками у 2001 році. Такий комплекс містить класичний НТН-домен, що доповнюється «крилатою» петлею між хеліксами 2 та 3. Таке «крило» є достатньо гнучким за відсутності ДНК, але у комплексі воно знаходиться у малій борозенці, де два залишки лізину створюють контакти з основами аденозину та тимідину.

Особливості контакту білку, що розпізнає ТАТА-бокс, з малою борозенкою. Як відомо, комплекс транскрипційного фактора TFIID з ДНК відіграє ключову роль у ініціації транскрипції еукаріот. Сам фактор діє за рахунок приєднання свого компоненту, TBP, до відомої сигнальної послідовності – ТАТА-боксу, яка розміщена вище оріджину зі старт-кодоном. Вже виявлено, що ТВР приєднується саме у регіоні малої борозенки з 5’-кінця та має декілька контактів з 3’-послідовності ТАТА у районі великої борозенки.

Було виявлено, що даний білок виявляє дуже сильну спорідненість саме до 5’-ТАТА послідовності у порівнянні з іншими А-Т збагаченими ділянками. Кристалічна структура ТВР у відсутності ДНК показує, що даний білок у домені, що контактує з ДНК, має симетричну α/β-будову. Така α/β-структура нагадує за формою сідло з витягнутим опуклим регіоном, який ідеально комплементарний до дуплексу В-ДНК та накладається на останній своєю увігнутістю. ЗА допомогою дослідів з експериментального мутагенезу було виявлено, що саме бічні ланцюги АК у регіоні увігнутості відповідають за взаємодію з ДНК.

Одначе, було показано, що ТВР з приєднаною до нього ДНК значно змінює свою форму. У даному випадку ДНК сильно згинається (приблизно на 80⁰) у процесі того, як вона точно прилягає до зігнутості у районі β-складчастого домену білку, тобто під прямим кутом до увігнутості у попередньо запропонованій моделі (слайд 14). Подібна структура була виявлена у послідовностях ДНК, які містили ТАТА-ділянки у комплексі з ТВР з широкого кола організмів, тому такий механізм приєднання білку до ДНК та впізнавання ТАТА-боксу вважається консервативним.

За умов приєднання ТВР до ДНК з β-складчастістю у районі «сідла» безпосередньо контактує вісім пар основ, які знаходяться не у В-формі. Одначе за умови приєднання білку до довших послідовностей, на 5’- та 3’-кінцях такого регіону ДНК зберігає В-конформацію. Вивчення структури комплексу ТВР з ДНК за 1,9 А на прикладі послідовності d(TATAAAAG) показало, що ДНК у регіоні зв’язування частково розкручується на 105⁰ на ділянці довжиною 7 пар основ, і тому характеризується значно подовженою, розширеною та сплощеною малою борозенкою, максимальна ширина якої складає 9 А. Саме така мала борозенка здатна прийняти на себе β-складчасте «сідло» білку ТВР.

Велика борозенка у такій ділянці ДНК навпаки значно звужена. До того ж, виявлено, що ДНК у регіоні зв’язування з ТВР характеризується позитивними кутами закручування до 40⁰ у ділянці 5’-ТАТА на парах А-Т, а також має пропелерний вигин під кутом – 39⁰ у регіоні 5’-АААА. Такі порушення геометрії ДНК пов’язуються з розгалуженими водневими зв’язками А-тракту з великою борозенкою. Складчастість цукрів нуклеозидів у регіоні зв’язування відноситься до типу С3’-ендо. Взагалі ДНК, приєднана до ТВР у ТАТА-боксі нагадує сильно зламану А-форму у самому регіоні боксу з різкою зміною структури на В-ДНК по обидві боки виходу з боксу.

Згинання ДНК у регіоні ТАТА-боксу створюється за рахунок пар залишків фенілаланіну, які уведені у кінці ТАТА-боксу та створюють стекінг з декількома основами та парами основ ДНК. Завдяки приєданню до фенілаланіну, дані основи втрачають стекінг усередині молекули ДНК, в результаті цього і формується вигин ДНК. Також у даній ділянці виявляються декілька контактів прямого зчитування між основами і АК, та численні контакти непрямого між АК та фосфатними групами ДНК. Більшість з останніх, особливо за участю лізину, опосередковані через молекули води.

Насьогодні існування подібного ТАТА-розпізнаючого комплексу доведено для транскрипційних факторів TFIIА (Ніколов з колегами, 1995 рік), та ТFIIВ (Тан та інші, 1996 рік). Обидва фактори створюють ТВР-ТАТА комплекси, описані вище, і вважається, що приєднання інших компонентів фактору транскрипції відбувається лише після формування повного контакту ТВР з ДНК (слайд 15, комплекс на прикладі першого з факторів), як, наприклад, у випадку негативного кофактора NC2, що було виявлено Камадою з колегами у 2001 році.

Інші білки, які індукують порушення та вигини структури ДНК. Серед таких варто відмітити наступні регуляторні білки, що приєднуються у регіоні малої борозенки:

1. Білки HMG (високо мобільні фактори) та споріднені до них – містять нейтральні ДНК-зв’язуючі домени, що приєднуються до ДНК так званими HMG-боксами у своєму складі. Одним з прикладів може слугувати білок SRY, який визначає рівень експресії чоловічих генів людини. Було виявлено за допомогою ЯМР, що HMG-бокс такого білку складається з трьох α-хеліксів, які формують L-подібну структуру, причому на внутрішній поверхні такої «літери» L розміщуються високо консервативні основні залишки аргініну та лізину. Жоден з даних хеліксів не нагадує структуру ділянок НТН, які ми розглядали раніше, тому HMG-бокси вважаються альтернативними ДНК-зв’язуючими регіонами білків. Мерфі, Світом та Черчілем у 1999 році була отримана кристалічна структура комплексу між білком HMG-D та збагаченим на пари А-Т дуплексним декамером ДНК, який після приєднання до білку сильно відрізнявся від канонічної В-ДНК, і мав невеликий згин (слайд 16). Білок приєднується у даному випадку до малої борозенки ДНК, що, як і у випадку ТВР, також є розширеною та сплощеною завдяки частковому розкручуванню, і більше нагадує борозенку у А-ДНК. Взагалі сам комплекс дуже нагадує розглянутий раніше ТВР-ДНК (слайд 16, зліва – ТВР-ДНК, зправа – НМG-D-ДНК), хоча мала борозенка у даному випадку є ще ширшою – 12,4 А.

2. НU-білки (гістонподібні) бактерій та білки родини HIF (integration host factor) – також можуть індукувати дуже великі згини ДНК, хоча за структурою відрізняються від розглянутих HMG-білків. Були відкриті та детально розглянуті зовсім недавно – Свінгером та Райсом у 2004 та 2007 році відповідно.

3. Гістони, що складають еукаріотичні хромосоми – здійснюють згинання ДНК для закручування останньої навколо нуклеосоми ( довжина закрученої ділянки корової ДНК - 145 пар основ). Структура нуклеосоми, про яку ми вже згадували, у кристалічному вигляді була отримана та визначена спочатку за 7 А Річмондом з колегами у 1984 році, та, пізніше, за 2,8 А, групою Люгера у 1997 році. Було виявлено, що дана структура являє собою октамерний гістоновий кор, навколо якого закручена ділянка молекули ДНК довжиною 146 пар основ, що загалом у результаті індукованого згину формує схожий на диск сплощений суперхелікс з псевдо-подвійною симетрією (слайд 17а та 18b). На виток приходиться 10,2 пар основ, згинання навколо кору має регулярний характер зі зберіганням характеристик В-ДНК. Пізніше, у 2003 році структура нуклеосоми була вивчена вже за 1,9 А, Річмондом та Дейві, такі досліди показали, що ДНК у нуклеосомі зберігає В-форму, але згинання її навколо октамерного кору не є регулярним завдяки ефектам на конформацію, пов’язаним зі гістоновими білками, анізотропною гнучкістю самої ДНК, та локальними змінами структури обох компонентів комплексу. Така нерегулярність дуже добре видно зі структури на слайді 18, де ми бачимо нуклеосомну ділянку В-ДНК, де присутні як прямі, так і зігнуті регіони молекули. Варто відмітити, що конформаційні параметри нуклеотидів та пар основ у складі корової ДНК змінюються синусоїдально, причому невелика перевага існує для згину у сторону великої борозенки. У 2005 році Тсунака з колегами отримали декілька послідовностей корової ДНК у складі кристалу нуклеосоми людини. Було виявлено декілька незначних відхилень у точному розміщенні шляху ДНК навколо октамеру, від моделі, представленої вище, одначе більшість параметрів збігалося.

4. Гістони та негістонові білки, що допомагають конденсувати ДНК до наступного рівня організації геному еукаріот – хроматинової фібрили. Кристалічна структура фібрили була отримана за 9 А Шальхом з колегами у 2005 році, у якій кожна з нуклеосом була поєднана у ланцюжок лінкерами довжиною по 20 пар основ, в результаті формувалася суперзакручена зигзагоподібна структура (слайд 19а та 20b, на прикладі тетрануклеосоми). На основі даних досліджень було розраховано цілу низку ймовірних моделей хроматинової фібрили з різною кількістю нуклеосом.