Потрійні хелікси днк

Феномен появи потрійних хеліксів ДНК для двох піримідинових і одного пуринового ланцюга був показаний ще у 1957 році Фельзенфельдом, Дейвісом та Річем. У ході експерименту використовували розчини полі-А та полі-У, які змішувалися у певних пропорціях, формуючи триланцюговий комплекс у співвідношеннях 1:1:1 – полі(У-АУ). Пізніше, у 1976 році, Арнотт запропонував моделі для двох типів подібних структур – рибо- та дезоксирибополінуклеотидів.

Було виявлено, що даний хелікс є право закрученим, а також те, що пуринова нитка парувалася з піримідиновою (тиміном або урацилом) через класичні зв’язки компліментарності, в той час як інша піримідинова (знову ж таки, через тимін або урацил) парувалася з тією ж пуриновою, але через зв’язки Хугстіна (слайд 5а та 6). Таке розташування водневих зв’язків дало початок так званому триплету основ, а сам хелікс отримав назву триплексу. Найточніше така структура була вивчена вже у 2000 році Чандрасекараном, Джіакометті та Арноттом. Було виявлено наступне:

1. Всі три цукри, які належать трійці нуклеотидів, у триплексі, що мав 12 обертів навколо осі, мають конформацію С2’-ендо.

2. Крок спіралі такого триплексу складає 38,4 А.

3. Полірибонуклеотид полі(У-АУ), що мав 11 обертів, характеризувався більшою кількістю варіантів конформацій цукрів – ланцюги мали відповідно С3’-ендо, С2’-ендо та С2’-ендо складчастості рибози.

4. Обидва типи триплексів були дуже схожими на А-ДНК.

Ще одним варіантом триплексу є той, який формується поєднанням ланцюгів через один гуанін та два цитозини, причому полярність його є тою ж самою, що й у розглянутого Т-АТ триплексу. Одначе, у даному випадку цитозин на третій нитці повинен бути протонованим на позиції N3 для того, щоб ефективно утворювати два водневих зв’язки пари Хугстіна (слайд 5b).

Виявлено, що триплекс Ц-ГЦ є ізостеричним до Т-АТ, однак протонування цитозину за N3 може відбутися за рН близько 5.0, що є нижче фізіологічного. Тому наразі є сумніви щодо існування такої структури у біологічних системах. Одначе існує можливість обійти дану проблему, а саме – замінити метильну групу у 5-му положенні цитозину на атом брому, що призводить до стабілізації триплексу за рН 7.0.

Довгий час триплекси були лише лабораторними розробками, доки не було виявлено, що ділянки потрійного хеліксу можуть формуватися шляхом приєднання олігонуклеотидів до певних послідовностей у нормальних дуплексах ДНК більшої довжини (слайд 6а та b). Наприклад, послідовність, що представлена на слайді 6 знизу, з ковалентно приєднаним до неї агентом розщеплення ланцюга, була використана для приєдання та розщеплення одного з унікальних сайтів на хромосомі дріжджів, демонструючи високу специфічність приєднання триплексів. Одначе, не дивлячись на специфічність, дані триплекси після формування дуже швидко руйнуються через особливе наближення негативно зарядженого фосфату третього ланцюга до двох ланцюгів дуплексу.

Як було уже сказано, паралельні варіанти триплексів Ц-ГЦ та Т-АТ за структурою нагадують, у першу чергу, А-ДНК. На слайді 7 представлено типовий триплекс з будовою, характерною саме для А-ДНК, причому третя нитка піримідинів лягає точно у велику борозенку дуплексу пурину-піримідину. Всі дезоксирибозні одиниці такого триплексу мають конформацію С3’-ендо, основи лежать на 3,5 А ближче до вісі хеліксу, кут оберту хеліксу становить менше 30⁰. Ширина великої борозенки складає 9,8 А, що є набагато більше, ніж у класичній А-ДНК, а мала борозенка має 10,7 А ширини, що майже ідентично до А-ДНК (11,0 А).

Було виявлено, що паралельні триплекси можуть формуватися відносно короткими послідовностями типу d(А)₁₂-2d(Т)₁₂, причому за будовою вони схожі скоріше на В-ДНК, бо мають С2’-ендо конформації цукрів, але параметри закручування все одно ближчі до А-форми. Це пов’язане головним чином з необхідністю розширення великої борозенки для того, щоб туди зайшов третій ланцюг. Цікавим є також те, що третій ланцюг ДНК у подібному ДНК-триплексі можна замінити на РНК, причому стабільність самого триплексу незначно зростає. Такий гібридний хелікс має В-характер, причому конформації цукрів у ДНК-частині зберігаються у формі С2’-ендо.

Насьогодні отримано зовсім небагато триплексів у кристалічній формі, які являли собою дуплекси з надлишковими кінцями, які й виступали у якості третього ланцюга, причому не дуже довгого, щоб докладно вивчити структуру триплексу. Одначе у 1995 році Беттсом був виявлений набагато довший фрагмент триплексу, що складався з 18-меру олігопіримідинової та білкової будови – так званої пептиднонуклеїнової кислоти (ПНК) – та 9-меру олігопуринового типу (слайд 7). Молекула ПНК представляє собою схожу з НК структуру, у якій цукрово-фосфатний кістяк замінено на незаряджений 2-аміноетилгліцин, що за розмірами дуже схожий на натуральний лінкер.

Такий комплекс ДНК-ПНК, який пізніше отримав назву Р-ДНК, був виділений у кристалічній формі (слайд 8) та являє собою структуру, відмінну як від А-, так і від В-ДНК – має 16 пар основ на виток, цукри у С3’-ендо конформації та велику відстань між основами – 6,8 А. Такий комплекс складається з десяти Т-АТ триплетів та восьми Ц-ГЦ, всі з них характеризуються паруванням за Хугстіном. Ще одна форма Р-ДНК, яка була отримана Петерсоном зовсім недавно, у 2005 році, взагалі має право- та лівозакручені ділянки, які чергуються.

Антипаралельні триплекси можуть формуватися шляхом поєднання Pu-PuPy, прикладом може слугувати триплекс з Г-ГЦ триплетами, причому зв’язки між Г та Г розміщуються так, як показано на слайді 8а, а самі пуринові ланцюги є антипаралельними один до одного. У випадку ж паралельного розташування, зв’язки розміщуються як на слайді 8b.

Як правило, подібні антипаралельні триплекси є незалежними від рН і більш стабільними, ніж паралельні, а гуанозинові нуклеотиди у складі третього ланцюга триплету можуть мати як син-, так і анти-конформацію навколо глікозидного зв’язку, хоча анти є більш переважаючою. На сьогодні поки не отримано жодної кристалічної структури антипаралельного триплексу.

Основною проблемою, пов’язаною з триплексами взагалі, є нестабільність приєднання третього ланцюга. Є декілька підходів до вирішення даної проблеми, одним з яких є використання так званих триплекс-селективних лігандів, тобто речовин, які здатні до інтеркаляції між триплетами, що схоже на інтеркаляцію у звичайний дуплекс, про що ми поговоримо дещо пізніше. Для даної цілі можна використати, наприклад, акрідини, які можна приєднати ковалентно до 5’- або до 3’-кінця третього ланцюга, що дозволить стабілізувати формування триплексу. Ще одним агентом у цьому відношенні є псорален, але він має обмеження використання для формування триплексів – приєднується специфічно лише за послідовністю 5’-ТрА та потребує УФВ для активації та формування ковалентних зшивок.

Альтернативою для стабілізації триплексів є використання модифікованих за кістяком нуклеотидів, наприклад N3’-P-фосфоамідитних похідних нуклеотидів дозволяє досягти більш міцної гібридизації з дуплексами, до того ж вони більш стабільні за клітинних умов, оскільки резистентні до дії нуклеаз.

Практичне використання триплексів можливе для:

1. Інгібування або регуляції транскрипції певних генів, використовуючи механізм формування триплексів з певними олігонуклеотидами у районі промотора або іншої регуляторної послідовності.

2. Сиквенсу певних ділянок генів за рахунок використання певних синтетичних олігонуклеотидів.