Загальні методи визначення вторинної структури нк

Реакції з хімічними реагентами є чудовим методом для визначення доступності кожного з реактивних сайтів на кожному нуклеотиді послідовності.

Реакційна здатність кожної основи є унікальною сама по собі, але специфічне оточення даних основ у нуклеотиді також модулює реактивність атомів. Наприклад, для ДНК та подвійно ланцюгових РНК вид конформації вторинної структури прямо впливає на реактивність нуклеотидів, причому перехідні стани між цими конфромаціями можуть бути найбільш активними у даному аспекті.Важливе значення для реактивності також мають невеликі зміни структури НК, наприклад, звуження або розширення малої боріздки ДНК.

Точні місця приєднання хімічних речовин або білків до ДНК або РНК може бути визначеними шляхом виявлення різниці у реактивності зв’язаної та «чистої» НК. Для РНК ковалентні реакції можуть виявити, які основи розташовані у одно ланцюговому регіоні молекули (вони є найбільш реактивними), які знаходяться спаренними, і яку структуру вторинного і навіть третинного типу формують. У структурі ДНК такі специфічні до одно ланцюгових ділянок реагенти допомагають знайти регіони паліндромів та шпильок.

Мічення кінців НК. Як правило, перед вивченням РНК або ДНК потрібно помітити за кінцевими нуклеотидами:

1. Мічення 5’-кінця здійснюється за допомогою γ-³²Р-АТР та фермента Т4 полінуклеотидкінази.

2. Мічення 3’-кінця проводиться Т4 РНК-лігазою, яка додає мічений рNр до 3’-гідроксилу ДНК або РНК.

3. Класичний метод мічення РНК за 3’-кінцем полягає у окисленні сусідніх 2’- та 3’-ОН-групи цукру періодатом (ІО₄^-) до 2’- та 3’-диальдегідів. Такі діальдегіди є нестабільними сполуками, але можуть швидко реагувати, наприклад, з амінами; подібна реакція може використовуватися для імобілізації РНК за 3’-кінцем на хроматографічній колонці.

4. Диальдегід потім може бути відновленим до більш стабільного диалкоголю за допомогою боргідриду (ВН₂^-); такий метод може використовуватись для подальшого мічення 3’-кінця РНК тритієм.

5. Якщо діальдегід обробити основою, відбувається β-елімінація, в результаті якої вивільняється кінцевий цукор та на його місці залишається 5’-фосфат. Таким чином, обробка 3’-кінця РНК періодатом з наступною елімінацією може бути використаною для позбавлення послідовності від термінального гуанозину у каталітичному інтроні рибосомальної РНК з Tetrahymena, як було показано Таннером та Чехом у 1987 році.

Хімічна модифікація НК. Існують два методи, що найширше використовуються для визначення відносного розташування модифікованих нуклеотидів у складі НК:

1. Хімічне розщеплення ланцюга з міченими кінцями у місці модифікованої основи,

2. Виявлення модифікованих основ шляхом визначення місць термінації ланцюга зворотною транскриптазою.

Перша з методик вже була розглянута нами, друга, як уже відмічалося, працює лише з використанням специфічних праймерів, комплементарних до аналізованого регіону, до того ж транскриптаза не зупиняється або уповільнюється на модифікованих основах у складі матриці. Кінець копіювання припадає саме на модифіковану основу, таким чином довжина копії визначає позицію даної основи. Такий метод, одначе, не є прийнятним для визначення послідовностей менших, ніж 20 нуклеотидів.

На слайді 11 представлені ті реагенти, які найчастіше використовуються у якості аналізаторів вторинної та третинної структур НК. Варто відмітити, що нуклеотиди у подвійно-ланцюгових регіонах молекул НК реагують дещо повільніше з даними реагентами, ніж ті, що розташовані у одно ланцюгових ділянках. Реакції, що проводяться за допомогою даних реагентів, показані на слайдах 10, 12 та 13.

1. Одним з прикладів найпоширеніших алкілюючих агентів для НК може слугувати ДМС – диметилсульфат (СН₃О(SO₂)ОСН₃), також широко використовуються метилметансульфонат (СН₃(SO₂)OCH₃) та N-етил-N-нітрозосечовина (ЕНС, СН₃СН₂N(NO)CONH₂). Як правило, всі атоми азоту та кисню основ, цукрів та фосфатів можуть бути алкілованими у водному розчині. Одначе, основні три сайти алкілування на основах за допомогою ДМС показані на слайді 10. Таким чином, реакції відбуваються за атомами N1 в аденіні, N3 у цитозині та N7 у гуаніні. Реакції алкілування аденіну та цитозину майже не відбуваються у подвійно ланцюгових регіонах молекули; реакція з гуаніном затруднена через стекінг-взаємодії та особливості будови третинної структури. Алкілування гуанінів ДМС посилює апуринізацію, подальша обробка може призвести навіть до розриву ланцюга у місці гуаніну. Розщеплення ланцюга можливе також у районі 3-метилцитозину після м’якого гідразинолізу. N1-метиладенін, утворений реакцією, виявляється, як правило, через зупинку на ньому зворотної транскриптази.

2. ЕНС відрізняється тим, що вона, в основному, алкілує фосфати НК з формуванням триефірів, що призводить до розщеплення ланцюга за м’яких лужних умов. Зв’язування реагенту з фосфатом залежить від конформації та доступності останнього.

3. Діетилпірокарбонат (ДПК) реагує з N7 аденіну (слайд 10), та, у меншому ступені, з N7 гуаніну та аміногрупою цитозину. Модифікація може бути виявлена через розщеплення ланцюга в її районі. У дуплексних регіонах N7 аденіну знаходиться близько біля великої боріздки, що уповільнює реакцію з ДПК. На динаміку реакції також впливає стекінг.

4. Карбодіімід (СМСТ) (слайд 12) реагує з N1 гуаніну та урацилу, або з N3 тиміну.

5. Кетоксаль, як і всі гліоксалі, реагує з N1-N2 гуаніну.

6. Бромацетальдегід додає алкільну групу до атомів N1-N6 аденіну (слайд 12).

Таким чином, за допомогою даних речовин виникає можливість моніторингу сайтів Уотсон-Криківських взаємодій та визначення дуплексних регіонів НК. Реагенти самі по собі не здатні викликати розщеплення НК, тому детекція ведеться через виявлення зупинок зворотної транскриптази.

Реагенти, які специфічно реагують лише з піримідинами (слайд 13) і також відрізняються швидшими реакціями у одноланцюгових регіонах НК, включають в себе:

1. Гідроксиламін (Н₂NOH), який реагує з уридином за таким же механізмом, що й гідразин (слайд 9); з цитозином гідроксиламін формує гідроксиаміноцитозин.

2. Бісульфіт-йон (НSO₃^-) додає групу у район подвійного зв’язку між атомами 5 та 6 піримідинового кільця, причому модифіковані таким чином основи виявляються через обробку гідразином та розщеплення ланцюга аніліном. Бісульфіт може каталізувати заміну атома водню в 5 положенні на дейтерій або тритій, таким чином він є придатним для введення міток зразу у У, Т або Ц олігонуклеотидів, щоб полегшити зняття спектрів ЯМР.

3. Тетроксид осмію у присутності піримідину додає групу до подійного зв’язку 5-6 кільця основи за умови наявності нуклеотиду у одноланцюговому регіоні НК. Обробка таким реагентом, так само, як і гідроксил аміном, може призвести до розщеплення ланцюга за місцем модифікації.

4. Перманганат-йон окислює повійний зв’язок 5-6 кільця піримідинів (особливо, у тиміні та урацилі, менше – у цитозині), призводячи до утворення 5,6-дигідроксисполук. Продукт реакції можна виявити шляхом ізоляції модифікованого нуклеотиду або хімічним розщепленням у районі сайту модифікації.

5. Гідразин, про який вже говорилось, також використовується для реакцій з піримідинами (слайд 9).

Нарешті, комплекс Ni²⁺, що реагує з N7 гуаніну, призводить до розриву ланцюга після окислення персульфатом. Такий комплекс має специфічність до рибонуклеази Т1, але може реагувати як з ДНК, так і з РНК. В основному, він краще реагує з гуанінами в одноланцюгових ділянках, одначе його реактивність значно підвищується у кінцевих ділянках подвійного хеліксу та малих петлях.