Визначення вторинної структури рнк

Багато з реагентів та ензимів, представлених вище, можуть бути використані також для визначення вторинної структури ДНК. Причому основним питанням, яке намагаються вирішити за допомогою даних методів – як впливає послідовність на формування подвійного хеліксу та де знаходяться незвичні структури (хрестоподібні ділянки, потрійні ланцюги, сполучення регіонів, і т.д.) та одноланцюгові регіони у молекулах ДНК.

Хімічна модифікація. Негативно-суперзакручена ДНК сприяє формуванню структур зі зниженим закрученням навколо пар основ, і, таким чином, індукує формування так званих хрестоподібних ділянок. До того ж, ланцюги ДНК розкручуються та формують шпильки на протилежних ланцюгах у місцях паліндромів або інвертованих повторів. Основи у петлях таких шпильок є гіперреактивними до певних селективних реагентів, якими можна визначити одно ланцюгові ділянки. Серед таких можна відмітити уже відомі нам бромацетальдегід, гліоксаль, тетроксид осмію, бісульфіт-йон.

Наприклад, тетроксид осмію можна використати для визначення хрестоподібних ділянок як іn vivo, так і in vitro. Сполучення між двома молекулами ДНК, які мають різну конформацію (наприклад, В- та Z-форми) також можна визначити за рахунок хімічної модифікації, оскільки вони ведуть себе, як регіони петель.

Формування потрійних ланцюгів (триплексів) індукується, як правило, у поліпуринових регіонах ДНК шляхом негативного суперскручування за низького рН. Утворення триплексу вивільнює один з ланцюгів, який також можна локалізувати за допомогою алкілуючих агентів. Одначе гуаніни у таких ділянках не реагують з ДМС, оскільки є захищеними від алкілування за N7.

І хімічно-синтезовані реагенти, і деякі природні біоактивні речовини можуть розщеплювати ДНК за оксидативним механізмом, який починається з абстракції атома водню з дезоксирибозного кільця. Утворений таким чином радикал далі реагує з такими оксидантами, як О₂ та Н₂О₂, що і призводить до розщеплення ланцюга. Продукти такої реакції залежать від того, який атом водню від’єднується:

1. Якщо протон відходить від 4’-положення цукру, то відбувається формування 5’-фрагменту з фосфогліколатним залишком на 3’-кінці. Завдяки додатковому негативному заряду карбоксильного залишку такий продукт мігрує трошки швидше у електрофоретичному полі, у порівнянні з відповідним 3’-фосфатним маркером з реакції Максама-Гілберта. 3’-кінцевий фрагмент зазнає β-елімінації та дає 5’-термінальний фосфат, плюс утворюється пропеналь, що походить з основи.

2. Якщо абстрагується протон з 1’-положення цукру, то утворюється 3’-кінцевий фрагмент, який має 5’-кінцевий фосфат, приєднаний у результаті елімінації. Можливо також виявити проміжний продукт даної реакції, у якому залишок цукру залишається приєднаним до 5’-кінцевого фрагменту, але далі даний інтермедіат входить у реакцію елімінації і дає 3’-термінальний фосфат та 5-метилен-2-фуранон у якості залишку дезоксирибози.

3. У випадку абстракції протона від 5’-положення дезоксирибози у присутності О₂ відбувається розщеплення ланцюга з вивільненням 5’-кінця з приєднаним до нього 3’-термінальним фосфатом. 3’-кінцевий фрагмент залишає собі окислене кільце дезоксирибози, причому на 5’-вуглеводі такої структури зберігається альдегідна або карбоксильна група. Ланцюг, що обірвався на карбоксильній групі, мігрує дещо повільніше, ніж маркер, отриманий за реакцією Максама-Гілберта, а той, що містить альдегідну групу – ще більш повільно, оскільки він не має заряду на кінцевій групі. Якщо окислювальне розщеплення відбувається у присутності сильної основи (ОН^-), атом водню альдегіду (Н4’), але не карбоксильної кислоти, виявляється достатньо кислим для індукції елімінації. У такому випадку альдегідний фрагмент замінюється 3’-термінальним кінцем, до якого приєднано 5’-фосфат.

Гідроксильні радикали є оксидативними агентами, які можуть формуватися під впливом йонів заліза у присутності кисню у якості відновлюючого агента, такі сполуки здатні розщеплювати цукрово-фосфатний кістяк полінуклеотидів.

Комплекс двовалентного заліза з етилендиамінтетраацетатом (ЕДТА) є одним з найбільш ефективних розщеплюючих агентів. У даному випадку сиквенс-специфічне розщеплення дуплексної ДНК досягається шляхом приєднання комплексу до олігонуклеотиду, який формує потрійний хелікс у сайті розщеплення.

Ще одним важливим у даному відношенні комплексом, який володіє здатністю до інтеркаляції в дуплекс ДНК, є комплекс заліза з етидіум-пропіл-етилендиамінтетраацетатом (МРЕ). Він є специфічним до подвійно-ланцюгових ділянок молекули ДНК і у поєднанні з молекулами О₂, завдяки атомам заліза, здатен продукувати гідроксильні радикали біля залишків цукру у малій борозенці ДНК. Першим етапом розщеплення у даному випадку є вже розглянутий нами механізм абстракції протона гідроксил-радикалом від С1’ або С4’ дезоксирибози.

Ще одним новітнім методом використання гідроксильних радикалів є детермінація числа пар основ на один виток дуплексної ДНК у розчині. Дана методика починається з адсорбції ДНК на фосфаті кальцію, потім у середовище додається комплексна сполука заліза з ЕДТА. У розчині за цих умов ДНК розщеплювалася після кожного нуклеотиду, але розщеплення адсорбованої молекули виявляється зниженою у місцях розміщення нуклеотидів, які контактують з поверхнею солі. Таким чином, були отримані фрагменти, за якими визначили, що саме 10,5 пар основ припадає на один виток такої спіралі (слайд 14). Також з цих дослідів можна робити висновки щодо варіабельності послідовностей ДНК, оскільки послідовності 5’-піримідин-пурин-3’ розщеплювалися з меншою швидкістю, ніж інші варіанти динуклеотидів.

Окрім структурних досліджень ДНК, комплекси з двовалентним залізом також використовуються для визначення доступності розчинників до РНК.

Активований світлом ураніл-ацетат має схожі з комплексами заліза та ЕДТА властивості. Він здатен розщеплювати ДНК та РНК неспецифічно на сайтах тих нуклеотидів, що є відносно доступними для розчинника.

Ще одним важливим комплексом зі здатністю до кисневого розщеплення ДНК є 1,10-фенантролін, зкомплексований з йонами міді. Механізм розщеплення у цьому випадку дуже схожий на той, що здійснюється гідроксильним радикалом. Він включає в себе атаку С1’ та С4’ положень кільця, але окислюючи ми агентами є скоріше не гідроксил-радикал, активна група комплексу [CuO]²⁺ та Н₂О₂ у якості кооксиданта. За даним методом хелікс полі(rА)-полі(dT) розщеплюється на 10-20% швидше ніж форма полі(dA)-полі(dT).

Також достатній рівень розщеплення даним комплексом був продемонстрований на Прибнов-боксах лактоз них протомерів Рs та L8-UV, що може свідчити про знаходження хеліксу незвичної будови в районі боксу. Розщеплення здійснювали через приєднання комплексу до 5’-кінця та послідуючого введення Н₂О₂.

Варто відмітити, що не всі послідовності можна розщепити даним методом. Наприклад, послідовність полі(dГ-dЦ) у середовищі з 3М NaCl взагалі не розщеплювалася вищезгаданим мідним комплексом, що, очевидно, свідчить про те, що дана ділянка ДНК знаходиться у Z-формі.

Інші комплекси, які здатні індукувати розщеплення ДНК in vitro:

1. Тріс(1,10-фенантролін)кобальт (ІІІ).

2. Тріс(4,7-дифенілфенантролін)кобальт (ІІ). Як і перший, активується під дією світла.

3. [Co(NH₃)₆]³⁺, або [Rh(phen)₃]³⁺, або [Ru(phen)₃]²⁺.

Механізми реакцій за участю останніх трьох комплексів, як правило, не потребують О₂, а самі методики входять в групу підходів фотоіндукованого розщеплення ДНК. Оскільки фенантролінові сполуки є хіральними (слайд 15), дані комплекси можуть навіть розпізнавати право- та лівозакручені ділянки ДНК, а також різноманітні модифікації. На слайді представлено комплекс, який не зв’язується з В-формою ДНК, але має спорідненість до Z-форми. Даний комплекс здійснював фоторозщеплення ДНК промоторних та енхансерних регіонів, а також ділянок нижче 3’-кінця у генах вірусу SV40. До однієї з ділянок розщеплення приєднувалися анти-Z-антитіла.

Аналогічні комплекси з рутенієм можуть відрізняти А-форму від В-форми ДНК, було також показано, що дані комплекси селективно приєднуються до різних регіонів рBR322. Це дозволяє зробити висновок, що регуляторні ДНК-послідовності, кодуючі гени, та інші регіони, всі знаходяться у різних конформаціях.

Використання нуклеаз. Як уже відмічалося, нуклеаза S₁ може розщеплювати обидва види НК, тому логічним є її застосування для визначення вторинної структури ДНК.

1. У складі ДНК дана нуклеаза здатна розщепити одноланцюгові регіони петель та хрестоподібних ділянок, внутрішні петлі, а також одноланцюгову ділянку, яка вивільняється після формування потрійного хеліксу,. Одначе даний фермент не діє на ділянки одиночних неправильно спарованих основ.

2. Локалізацію інтронів та екзонів у складі геномної ДНК, як правило здійснюють шляхом гібридизації відповідних мРНК з ДНК. Інтрони не є комплементарними до РНК, тому ДНК у процесі гібридизації буде формувати однониткові петлі. Саме нуклеаза S₁ може бути використаною для розриву даних петель.

3. Число пар основ на виток ДНК, адсорбованої на плоских поверхнях, також було виявлено за рахунок використання нуклеаз. Після імобілізації ДНК на кальцій-фосфатних кристалах або порошковій слюді, дані молекули, як правило, обробляються ДНКазою І або мікрококовою нуклеазою. Таким чином було показано, що випадкові послідовності ДНК та регулярні полі(dА-dТ) ділянки показали по 10,5-10,6 пар основ на виток, в той час як гомополінуклеотид полі(dА) – полі(dТ) дав значення 10,0 пар основ на виток.