Визначення третинної структури нк

Всі хімічні та ензиматичні методи, розглянуті вище, можуть застосовуватись також і для виявлення третинної структури ДНК та РНК. Щодо РНК, то найбільшу увагу дослідників привертає сама тРНК, як найбільш модифікована, не дуже велика молекула, яка, до того ж має найбільш виражену третинну структуру. Часто, для дослідження третинної структури тРНК використовують метод виміру швидкостей обміну тритію з атомом Н8 пуринів. У ДНК третинна структура вважається основним фактором захисту молекули від дії нуклеаз або хімічних розщеплюючих агентів. Тому її вивчення є також дуже важливим.

Швидкості реакцій з хімічними реагентами, ферментами або міченою тритієм водою залежать від доступності сайтів цих реакцій. Кінетика, таким чином, контролює реактивність. Одним з методів, визначення структури НК, який залежить від термодинамічної рівноваги, є вивчення кінетики зв’язування олігонуклеотидів з НК. Ступінь такого зворотного зв’язування, у свою чергу, залежить від послідовності і конкурентності між внутрішньомолекулярним зв’язуванням з доданим олігонуклеотидом та приєднанням до інших послідовностей до молекули-мішені. Рівноважний діаліз радіоактивно-міченого олігонуклеотида дуже часто використовується у якості визначника ефективності зв’язування, але можна використати і флуоресцентну методику. Далі розраховуються константи рівноважного зв’язування для певного набору нуклеотидів та отримані їх відносні значення інтерпретуються по відношенню до зв’язування у одноланцюгових або просто-структурованих регіонах.

Метод хімічного утворення перехресних зшивок. Реагенти з двома реактивними групами на одній молекулі можуть бути використані для поєднання нуклеотидів, які значно віддалені один від одного у послідовності. Така взаємодія нагадує елементи вторинної або третинної структури. У будь-якому випадку такий зв’язок зближує нуклеотиди між собою, що впливає на просторову організацію та властивості НК. Локалізація даного зв’язку може бути здійснена у загальному плані за допомогою електронної мікроскопії, або, більш точно, за допомогою часткового гідролізу НК та ідентифікації нуклеотидів, що прореагували.

Основними з перехресних агентів, що використовуються у даних методиках для визначення тривимірної структури НК є:

1. N-ацетил-N’-(р-гліоксилбензоїл)цистамін,

2. Біс(2-хлороетил)-метиламін («нітрогірчиця»),

3. Р-азидофеніл-ацетимідат,

4. Імінотіолан.

Всі ці речовини були використані для визначення тривимірної структури 16S рРНК. Даний метод можливо комбінувати з іншими підходами, такими, як:

1. Фотозшивки за допомогою псоралену,

2. Зшивки під впливом УФВ,

3. Крос-зшивки,

4. Хімічні модифікації,

5. Філогенетичне порівняння.

Така комбінація дає достатньо точний інструмент вивчення тривимірної структури НК. Коротко розглянемо представлені методи.

Псораленові фотозшивки. Псорален являє собою циклічну сполуку, яка має три гетероцикли у своєму складі (слайд 15, право зверху). Така речовина входить до класу сполук, які специфічно реагують з НК за фотореактивним механізмом, отже зшивок білок-НК вони не дають, а зшивають лише НК.

За відсутності УФВ ніякої реакції не відбувається, а за його присутності можливе формування зшивок як in vitro, так і in vivo. Серед даної групи речовин найбільш вживаними є:

1. 4’-гідроксиметил-4,5’,8-триметилпсорален (НМТ),

2. 4’-амінометил-4,5’,8-триметилпсорален (АМТ).

Обидві з речовин реагують і з ДНК, і з РНК, але фотореакція з ДНК йде краще.

Механізм фотоінсертції псоралену у хелікс нуклеїнової кислоти відбувається у декілька стадій (слайд 15, внизу):

1. Початковою стадією є інтеркаляція псоралену у хелікс НК у темряві.

2. Після інтеркаляції псоралену здатен поглинати світло з довжиною хвилі між 300 та 400 нм, причому фотон приймається або подвійним зв’язком атомів 3-4 піронового кільця, або зв’язком 4’-5’ кільця фурана

3. Після абстракції фотона дані зв’язки набувають реактивності і реагують з подвійним 5-6 зв’язком прилеглого піримідину за механізмом циклоаддикції.

4. Наступна циклоаддикція відбувається за місцем протилежного ланцюга НК, але якщо виконуються дві основні умови. Перша – сформований моноаддукт повинен знаходитись на фурановій стороні псоралену (тобто, утворитись за зв’язком 4’-5’). У такому випадку структура буде мати будову похідного кумарину, і зможе абсорбувати ще один фотон між 300 та 380 нм і здійснити перехресну зшивку. Друга – піримідин повинен прилягати до моноаддукту псоралену, розміщеного на протилежному ланцюзі.

5. Останньою стадією є формування перехресної зшивки між ланцюгами, якщо інтеркаляція відбулася у сайтах 5’-пурин-піримідин-3’ або 5’-піримідин-пурин-3’ хеліксу.

Швидкість подібної реакції залежить від послідовності та виду окремих основ – відомо, наприклад, що тиміни та урацили є більш реактивними, ніж цитозини. Більше того, сайти будови 5’ТрА3’ є набагато фотореактивнішими, ніж сайти 5’АрТ3’. Конфігурація такої фото зшивки була добре вивченою за допомогою кристалографічних та ЯМР-досліджень.

Подібний підхід був застосований у дослідженні структури ДНК з вірусних часток, наприклад циклічної одноланцюгової ДНК бактеріофага fd, яка складається з 6408 основ. Причому оріджин реплікації такої ДНК знаходиться у регіоні чотирьох шпильок, які, у випадку перехресних зшивок, добре візуалізуються за допомогою електронної мікроскопії. Частка фага являє собою довгий циліндричний філамент з ДНК у центрі. Дослідження з введенням псораленових зшивок, проведені Хонгом та Херстом, довели, що оріджин знаходиться саме на одному з кінців філаментного фага.

Також за допомогою псораленового методу вивчалася структура 16S рРНК Томпсоном та Херстом. Спочатку була складена карта зшивок за допомогою електронної мікроскопії, пізніші дослідження показали точне розташування урацилів, які були поєднані перехресно. Карти були згенеровані як для самої рРНК in vitro, так і для молекули у складі 30S-субодиниці рибосоми. Виявлено повну схожість вторинної структури РНК у обох випадках.

Подібні підходи фотоперехресних досліджень також можна застосувати для вивчення кінетики та рівноважних процесів гібридизації між малим олігонуклеотидом та великою молекулою НК. Фотоактивований псоралену, введений у склад олігонуклеотиду, можна використати у якості гібридизаційного зонду, який можна незворотньо приєднувати до послідовності-мішені за умови опромінення УФВ. Така гібридизація олігонуклеотидної проби до НК дуже часто є затрудненою через конфігурацію структури мішені, тому оптимальне приєднання потребує швидкої фіксації, яка відбувається практично зразу після проведення імпульсного опромінення середовища.

Використання зшивок, індукованих УФВ. Як відомо, опромінення НК за допомогою УФВ довжиною хвилі 200-300 нм, призводить до утворення перехресних зшивок. Хімічна структура таких зшивок до кінця не вивчена, але їхнє утворення може дати корисну інформацію щодо третинної структури згорнутої ДНК або РНК.

Як правило, така зшивка являє собою піримідиновий димер, у якому окремі піримідини поєднані за допомогою циклобутилового кільця навколо їх зв’язків 5-6. Відомо чотири ізомери таких димерів – два з цис-структурою, коли основи розташовані прямо навпроти, і два у конформації транс, коли кільця піримідинів розташовані на двох протилежних полюсах циклобутанового кільця.

До того ж, зв’язки між атомами N1 та Н (глікозидні) можуть бути паралельними (конфігурація син) або антипаралельними (анти). У дуплексній ДНК можливі лише конфігурації ізомерів цис-син, що визначається орієнтацією сусідніх піримідинових нуклеотидів.

Ще одним джерелом зшивок у НК є фотоокислення пуринів у присутності кисню. Взагалі, фотоутворення перехресних зшивок має перевагу над використанням хімічних методів зшивання, оскільки не виникає потреба додавати багато реагентів до розчину НК, таким чином не порушується рівновага між видами вторинної структури ДНК або РНК.

Тема.... Методи дифракції рентгенівських променів у кристалах, ЯМР, та молекулярного моделювання у дослідженні структури НК

Дифракція рентгенівських променів у нитках та кристалах як метод структурного аналізу НК

Принцип методу дифракційних досліджень. Рентгенівські промені (Х-промені), як правило, мають довжину хвилі, яка добре співвідноситься з розмірами міжатомних зв’язків у молекулах (біля 1,5 ангстрема). Впорядковане розсіювання (або дифракція) Х-променів молекулами є результатом взаємодій між випроміненням та електронами, розподіленими на кожному атомі структури. Типові дифракційні картини ДНК у формі ниток або окремих кристалів, показані на слайді 16 (зліва – дифракційна картина одного кристалу комплексу ДНК з хімічно-синтезованою сполукою, роздільна здатність 1,6 А, зправа – дифракційна картина нитки В-форми ДНК з тимусу теляти).

Після зняття дифракційних картин проводиться обробка результатів розсіювання, в результаті якої реконструюється молекулярна будова сполуки, підданій аналізу. Дифракційна картина – це, по суті, репрезентація розподілу електронної щільності молекули.

Реконструкція структури не є прямо-інтерпретуючою, оскільки частина інформації у процесі отримання картин втрачається через неможливість виявлення відбитків деяких індивідуальних Х-променів у процесі дифракції. Такий феномен називають фазовою проблемою і існує цілий ряд методів для її вирішення, про які ми поговоримо дещо пізніше. Без вирішення даної проблеми розрахунок електронної щільності у трьох вимірах з високою точністю ( у вигляді серії Фур’є), відомий як карти Фур’є, не є можливим.

Близьке співвідношення довжин хвиль Х-променів та відстаней між атомами у зв’язках () в принципі означає, що електронна щільність всіх індивідуальних атомів у молекулі може бути визначена за умови, що картина дифракції Х-променів буде реконструйована у вигляді реального у співвідношеннях відстаней тривимірного зображення.

Ступінь детальності отриманої електронної щільності прямо залежить від роздільної здатності записаної картини дифракції. Причому роздільна здатність може виразитись як найкоротша відстань між об’єктами (у даному випадку – атомами або групами атомів у молекулі), яку ще можна спостерігати роздільно на картині, реконстутийованіх з дифракційної поверхні. Ліміт такої роздільної здатності (r) залежить від максимального кута дифракції (θ), за якого записувалися дані, та довжини хвилі (λ) Х-променів:

За умов роздільної здатності у 2,5 А індивідуальні атоми структури ще не можуть бути виявлені на карті електронної щільності, хоча форма та орієнтація кільцевих систем (наприклад, пар основ) вже може бути розрізнена. Такі ділянки з’являються на картах у вигляді довгастих регіонів електронної щільності з замісниками у вигляді відростків від основної плями.

За роздільної здатності у 1,5 А індивідуальні атоми вже виявляються на карті, хоча лише за 1,0-1,2 А всі атоми повністю видимі та розділені один від одного (слайд 17, а – 0,9 А, b – 1,25 A, c – 1,5 A, d – 2,0 A та e – 2,5 A).

Останнім часом дослідження з особливо малою роздільною здатністю (менше 0,8 А) зазнали потужного поштовху через використання нових, так званих високопотокових синхронтронних джерел Х-променів. Насьогодні існує близько 20 таких синхротронів саме для кристалографічних досліджень. На 2005 рік у банк даних структури білків надійшло 4515 структур, з них 3398 (близько 78%) отримані з використанням синхротронів.

Синхротрони мають більшу потужність випромінювання, ніж звичайні лабораторні джерела, чим і пояснюється більша роздільна здатність, а також можливість використовувати менші кристали речовин. Також була значно вдосконалена оптична складова методу, плюс набула розповсюдження методика збирання дифракційних картин з макромолекул за температури рідкого азоту, використовуючи метод флеш-фрізингу. Такий метод дозволяє зменшити до мінімуму розпад кристалу у Х-променях та збільшити потужність розсіювання.

Окрім роздільної здатності результат кристалографії залежить також від розміру кристалографічної одиничної клітинки. На це впливає також число унікальних відбивань, яке залежить від ступеню симетрії кристалу. Наприклад, за роздільної здатності 0,74 А структура кристалу декамеру типової ДНК дасть близько 29000 унікальних максимумів відбиття у моноклінальному просторі. Для порівняння, олігонуклеотид з 12 нуклеотидів за 2,2 А у орторомбічному просторі дає лише біля 3000 таких максимумів, що і було верхом досягнень ще декілька років раніше.

Вимірювана інтенсивність індивідуальних відбитків є пропорційною до амплітуди структури, або, по-іншому, структурного фактора, який повинен співвідноситись з так званою фазовою інформацією. Структури, отримані за допомогою кристалографії, як правило, завжди оптимізуються (стандартизуються) під дані структурної амплітуди.

Для визначення ефективності методу для певної моделі часто використовують два параметри:

1. Кристалографічний R-фактор, що визначається як:

тобто, є сумою всіх спостережених відбиттів, причому F₀ та F_C представляють собою спостережений та розрахований структурні фактори. R, який часто називають коефіцієнтом достовірності, виражається у відсотках.

2. Так званий вільний R-фактор (R_free), який визначається по відношенню до всього лише 5% відбиттів, які часто обираються довільно. Такий параметр визначається лише з референтними цілями.

Значення R для конкретної моделі, яка була відповідним чином оптимізована, становить до 20%, а взагалі, чим нижчим воно є, тим більш достовірною видається модель. R_free, як правило, на декілька відсотків вище, але є дуже чутливим до найменших помилок та змін у розрахунках моделі. Таким чином, останній параметр є перевіркою на повноту структурного аналізу, а також на взаємодію дослідної речовини з молекулами води, та поведінку останніх.

Дифракція у нитках НК. Саме даний метод був історично найпершим, а також дав інформацію для Уотсон-Криківської моделі структури ДНК у 1953 році. За цією методикою полімерні молекули ДНК прямо екстрагували з ядра клітини, не піддаючи кристалізації. Перші спроби отримати дифракційні картини ДНК цим методом були здійснені Астбюрі у 1937 році, але вони були дуже поганої якості, ситуація покращилась лише на початку 50-их рр. у дослідах Франклін. Вона здійснила переорієнтацію отриманої ДНК у впорядковану структуру через методику вигягання самої молекули під час виділення так, що вісь хелікса прямо співпала з довгою віссю молекули.

Як натуральні, так і синтетичні НК здатні формувати нитки з різними ступенями внутрішньої впорядкованості, яка нагадує одно- або двовимірну паракристалінне середовище. Таке чергування ступенів порядку структури і дає дифракційні картини ниток, причому подвійні хелікси як ДНК, так і РНК показують впорядкованість саме вздовж вісі ланцюгів. Такий феномен дає початок унікальним для цього методу картинам, наприклад, спостережена Франклін ділянка хеліксного хреста в центрі картини дифракції хеліксу В-форми ДНК. Такі ділянки можуть бути проаналізовані для виявлення конфірмаційної форми ДНК, а також параметрів хеліксу – кут закручування, період, повторюваність, кількість основ на виток, довжини окремих елементів, тощо.

Одначе даний метод має і свої обмеження. Головне з них – низька роздільна здатність, що не дозволяє використовувати даний метод для визначення повної тривимірної структури НК. Навіть найкращі паракристалінні структури у нитках дають лише декілька сотень індивідуальних максимумів, що відповідає лише 2,5 А. Одначе, ефективність результатів можна підвищити за рахунок різних підходів до розрахунку. Наприклад, використання процедури ліст-скверингу допомагає оптимізувати значення R данного методу до величин 0,15-0,25, що є доволі непоганим показником ефективності.

Хоча дана методика вже майже своє віджила, її поки що не збираються забувати, оскільки дані щодо визначення видів конформацій ДНК та РНК, отримані раніше за допомогою дифракції у нитках, майже повністю співпадають з пізнішими, виявленими на кристалах.

Дифракція у одиничних кристалах. Даний метод, на відміну від попереднього, є більш сучасним та дозволяє повністю визначити третинну структуру ДНК та РНК. При цьому не потрібно навіть створювати якісь теоретичні моделі, оскільки кристали є набагато більш впорядкованими, ніж паракристалінні субстанції ниток НК. Таким чином, одиничні кристали можуть бути визначені як впорядковані скупчення дискретних та ідентичних молекул у трьох вимірах.

Створення кристалів ДНК та РНК було проблемою та залежало скоріше від удачі аж до початку 90-их років минулого сторіччя, коли було систематизовано великий діапазон умов кристалізації та стали випускати спеціальні комерційні кіти з певними концентраціями робочих рідин (буферних, контр-йонних, преципітаційних агентів) для приготування кристалів. Такі кіти дозволяють не лише формувати кристали, а також виявляти альтернативні форми кристалів у випадку, якщо вихідна форма не є придатною для аналізу (низька інтенсивність дифракційних картин, великі одиниці структури). Останнім часом набули широкого розповсюдження комп’ютизовані методи формування кристалів, які володіють широким діапазоном умов та надзвичайною ефективністю навіть для відносно складних комплексів – білок-НК, мультисубодиниці.

Діапазон роздільних здатностей у для НК даному випадку коливається від 0,7 до 3,0 А. Таким чином, даний метод має роздільну здатність, що співвідноситься з атомними відстанями (δ0,02 А для відстаней та δ0,2⁰ для кутів). Причому звичайний типовий структурний аналіз за 2,5 А для порівняння має δ0,3 А та кути δ5⁰. Одначе така детальність отриманих структур являє собою труднощі інтерпретації такого масиву даних без помилок, тому в даній галузі без комп’ютеризації обробки, як правило, не обходиться.

Картини дифракції олігонуклеотидних кристалів у даному випадку для визначення структури аналізують за допомогою стандартних важкоатомарних множинних та одиночних фазових методів ізоморфного заміщення, які відносяться до групи методів молекулярної кристалографії. Для аналізу картин з подвійних хеліксів через затруднення, пов’язані з парами основ, часто використовуються методи фазового заміщення у комбінації з аномальним розсіюванням на певній довжині хвилі.

Найбільш ефективною фазовою технікою аналізу результатів дифракції одиничних кристалів, отриманих за допомогою синхротронів, є аномальна дифракція на множинних довжинах хвиль. У її ході використовується певний важкий атом, який має здатність абсорбувати Х-промені на різних довжинах хвиль, що, виходячи з різної інтенсивності абсорбції, дозволяє отримати аномальні карти електронної щільності та за ними розрахувати потрібні дані. Такими атомами, які посилають так звані аномальні сигнали дифракції, можуть бути атоми брому або йоду, які дуже добре хімічно приєднуються до уридилових нуклеотидів.

У випадку, коли Х-промені здатні руйнувати зв’язки між галогеном та урацилом, використовують альтернативні підходи:

1. Нуклеотиди з сіркою (для приєднання похідного ртуті),

2. Фосфороселеноати замість фосфатів у нуклеотидах,

3. Заміна кисню на селен у 2’ позиції тимідину або уридину,

4. Заміна кисню на селен у 4-позиції тимідину.

Нуклеотиди з приєднаним селеном формують кристали, що ростуть набагато швидше, до того ж, дають дифракційні картини вищої якості, ніж ті, що з бромом.

Також у кристалографії одиничних кристалів застосовують так звані пошукові методи або методи молекулярної заміни, коли дифракційні картини, отримані з кристалу НК, співвідносяться за параметрами з кристалом визначеної будови. Таким чином, шляхом порівняння було уточнено з високою роздільною здатністю будову подвійного хеліксу ДНК. Такі методи використовуються, коли попередні (фазові, важкоатомні) не дають потрібного результату. Якщо ж геометрія структури добре відома, можна обійтись навіть без важких атомів, тобто, здійснювати аналіз лише на основі математичних викладок – так звані «прямі» фазові методи.

Приведення отриманих результатів у відповідність (так званий рефайнмент або оптимізація) забезпечується на основі методів масштабування (так званий ліст-скверинг), які допомагають мінімізувати різницю між спостереженою та розрахованою моделями. Процес рефайнмента включає в вирахування співвідношень між отриманими даними та розрахованими структурними параметрами – довжинами зв’язків, кутами між зв’язками, планарною геометрією основ ДНК, значеннями торсійних кутів, тощо).

Найбільш використаною програмою оптимізації кристалографічних результатів є X-PLOR/CNS, яка використовує також емпіричні енергетичні значення для визначення геометрії структури.

Ще одним варіантом рефайнінгу є техніка симульованого віджигу, яка використовується у випадку, коли оптимізуються структури за великої роздільної здатності () і треба врахувати атомічні рухи, оскільки методи скверінгу не підходять у цій ситуації.

Однією з проблем методу кристалографії є те, що кристали олігонуклеотидів та комплексів білок-НК виходять сильно-гідратованими, з масою розчинника іноді більше 50%. Більшість цієї води на картах не відображається, оскільки молекули мають високу рухливість, тому плями, утворені ними, змазуються до рівня шумового фону. Залишається лише та вода, яка є найменш мобільною, яка прямо приєднана за допомогою водневих зв’язків до структури НК, тобто належать до найближчої гідратної оболонки.

Ще одним обмеженням методу є те, що за переходу молекули НК у кристал можливе формування зв’язків (в основному, водневих та Ван-дер-Ваальсових) між частинами молекули, які за нормальних умов не є з’єднаними. Це може модифікувати структуру та конформацію, і, отже, призвести до неточностей у визначенні структури. Саме для врахування даного феномену і вводяться параметри достовірності R та R_free, про які ми вже говорили.

Взагалі, особливості будови НК, які беруться до уваги для точного з’ясування структури методом кристалографії включають в себе:

1. З’ясування розміщення близьких внутрішньо- та міжмолекулярних контактів, які за відстанню між взаємодіючими компонентами є меншими, ніж Ван-дер-Ваальсові радіуси відповідних атомів у складі контакту.

2. Розподіл значень торсійних кутів навколо одиничних зв’язків. Поява екліпсованих кутів (менше 0⁰) вказує на проблему методу рефайнінгу.

3. Водневі зв’язки з дистанціями менше ніж 2,7-3,2 А.

4. Визначення помилок у позиціях атомів.

5. Якість картин електронної щільності для індивідуальних груп та атомів.

6. Величини атомних температурних факторів, особливо для молекул води.