Тема 6. Неканонічні та нестандартні форми структурної організації днк Формування неправильних пар основ

Прийнято вважати, що пари основ в ДНК можуть формуватись виключно через ті водневі зв’язки, які формуються за правилом копмплементарності, розробленим Уотсоном-Криком та Чаргаффом. Одначе, насправді існує теоретично біля 16 варіантів формування водневих зв’язків у парах А-Т та Г-Ц, хоча не всі вони були спостережені на практиці.

Вперше нестандартне парування основ було виявлене Хугстіном ще у 1963 році, і було названо ім’ям дослідника. Таким чином, з’явилися прямі та зворотні пари Хугстіна (слайд 2), що були знайдені у деяких кристалічних структурах комплексів аденін-тимін та аденін-урацил. Різниця з класичною парою полягає у наступному:

1. Зв’язки починаються з атомів N6 та N7 аденіну, а не N1 та N6, як у класичній парі.

2. Поєднання аденіну з тиміном відбувається зі сторони краю аденіну, що направлений у сторону великої борозенки ДНК, тому такий край розташований під прямим кутом по відношенню до класичного положення аденіну у А- та В-ДНК.

3. Аденіновий нуклеотид у парі Хугстіна повинен бути у син-конформації навколо глікозидного зв’язку, якщо орієнтація ланцюгів у хеліксу є антипаралельною.

Взагалі найчастіше формування неправильних пар відбувається через помилки у реплікації, причому можуть утворюватись наступні варіанти пар:

1. Г-А,

2. Г-Т,

3. А-А,

4. Г-Г,

5. Т-Т,

6. Ц-Ц,

7. Т-Ц,

8. А-Ц.

Як правило, за відсутності репарації, дані пари можуть призвести до мутацій та нонсенсних чи неправильних продуктів генів. Існує система точкової (ексцизійної) репарації таких помилок, яка діє через розкручування хеліксу, вирізання (ексцизії) помилкового нуклеотиду та заміни його на правильний.

Було припущено, що багато з таких помилок парування виникають через наступні причини:

1. Зниження енергії та сили стекінгу основ між собою.

2. Використання помилкових пар для розпізнавання та індукції репараційних сигналів.

3. Помилки загальної реплікації.

4. Помилки копіювання певних ділянок ДНК, як правило тандемних, які пов’язані з розвитком генетично успадкованих захворювань.

Неправильні пари часто дестабілізують хелікс, що можна спостерігати за зниженням температури плавлення ДНК. Найбільш вивченим у даному сенсі є димер А-Г. Інші структурні дослідження були проведені на А-, В- та Z-формах ДНК для пар Г-Т, І-Т, У-Г, І-Ц та І-А. Було також показано, що антираковий препарат 6-тіогуанін (S6G) здатен інкорпоруватися у ДНК після перетворення на відповідний трифосфат, що також призводить до появи неправильних пар S6G-Ц та S6G-Т, які дуже схожі за структурою на пари Г-Ц та Г-Т, одначе є набагато менш стабільними.

Ще одним джерелом неправильних пар є дія метилюючих агентів, що вводять залишки метилу у основи, наприклад, таких канцерогенів, як бензпірен, який, як і більшість з метилюючих речовин, найчастіше вводить метил у О6-положення гуаніну.

Нестандартні пурин-пуринові пари. Було отримано цілий ряд кристалічних структур послідовностей з неправильними парами пурин-пурин, а саме А-Г, деякі з них представлені у таблиці на слайді 2. Конфігурація пари Г-А представлена на слайді 3 зверху (а – анти-анти, b-анти-син). Перша з цих конформацій (анти-анти) розсуває ланцюги ДНК далі, ніж у класичній В-ДНК, причому відстань між атомами С1’-С1’ складає 10,4 А. Така конфігурація була виявлена лише у одній кристалічній структурі – з двома А-Г парами поряд. Другий варіант пари (анти-син) є компактнішим, тому зустрічається частіше першого, причому у син-формі може бути як А, так і Г.

Всі послідовності з А-Г парами зустрічаються виключно у складі лише В-ДНК з послабленим стекінгом по відношенню до сусідніх нормальних пар основ. Причому у ділянках 5’-Py-Pu-Pu середній неправильно спарований пуриновий нуклеотид має лише анти-конформацію.

Скеллі зі співробітниками у 1993 році були виявлені також пари Г-Г, причому вони знаходилися у В-ДНК та мали конформації анти-син (слайд 3 зліва). Формування такої пари часто супроводжується зміною відстаней між фосфатними групами у протилежних ланцюгах, такі зміни вважаються сигналом для репараційних нуклеаз.

Було також виявлено, що у олігонуклеотидах з парами Г-А глікозидний кут може змінитися на протилежний зі зміною рН. Так, високе рН дає анти-анти, в той час як низьке може призвести до зміни конформації на анти-син. Пари Г-А, як правило, мають водневі зв’язки між атомами N7-N2 та N3-N2 на олігонуклеотиді d(ATGAGCGAATA)₂, який має чотири таких пари, і вони є найбільш стабільними. Взагалі, як правило, послідовність 5’-Py-GA-Pu формує достатньо стабільні неправильні пари.

Подібна структура, яка являла собою тандемні Г-А пари з конфігурацією анти-анти (слайд 3 знизу), була виявлена також на послідовності d(CCGAATGAGG), яка є моделлю ДНК у районі центромери. Такі пари були названі стриженими, оскільки вони мають основи одна над одною, що зменшує об’єм молекули у даній ділянці. Варто відмітити, що саме через таке розташування нуклеотидів стекінг-взаємодії між основами (Г/Г або А/А) є сильнішими, що додатково стабілізує дану структуру.

Неправильні пари, пов’язані з алкілуванням основ. Метилювання у положенні О6 гуаніну в ДНК призводить дестабілізації утвореної пари Г(ОМе)-Ц та транзитної мутації даної пари на Г(ОМе)-Т під час реплікації молекули.

Метилювання карбонільної групи у положенні О6 гуаніну до того ж призводить до зміни подвійного зв’язку С6-О6 на одинарний, і, таким чином, змінює весь таутомерізм кільця гуаніну, відбираючи атом водню від N1. Було показано за допомогою ЯМР, що пара Г(ОМе)-Ц у В-ДНК має анти-анти конформацію з формуванням так званого «хиткого» водневого зв’язку виключно між положеннями N2 гуаніну та О2 цитозину, та направленням метильної групи біля О6 гуаніну у сторону цитозину (слайд 4а).

У складі Z-ДНК було виявлена пара Г(Ме)-Ц, яка за параметрами зв’язків є ближчою до класичного варіанту (відстані між О6 гуаніну та N4 цитозину та N1 гуаніну та N3 цитозину) – слайд 4b. Така пара, хоч і зберігає протони на атомах N1 гуаніну та N3 цитозину, все ж є менш стабільною, ніж класична.

Ще однім варіантом неправильної метильованої пари є А-Г(Ме), яка була виявлена у кількості двох пар Джінеллом у 1994 році у складі одного додекануклеотиду, причому вона мала конфігурацію син-анти відповідно - слайд 4с.

Ще однією неправильною парою є Г(ОМе)-Т, яка також дестабілізує хелікс, має класичний варіант двох водневих зв’язків, і була знайдена у додекамері (слайд 4d). Був також знайдений альтернативний варіант даної пари, який має лише один водневий зв’язок між основами, на послідовності d(CGTGAATTCG(OMe)CG). За величиною всі ці пари майже не відрізняються від класичної.

Ще одним варіантом неправильної пари є та, яка виникає після метоксилювання позиції N6 аденіну за допомогою гідроксил аміну з появою метокси-аденіну, що парується з цитозином (слайд 4е). Для появи такої пари модифіковані аденіни мають бути у іміноформі, що маскує їх під гуанін. Тому частіше у таку пару під час реплікації входить саме цитидин, а не тимідин, хоча і останній не є виключенням.

Окисний стрес після атаки вільними радикалами може призвести до модифікації основ, особливо гуанінів, з утворенням похідного 7,8-дигідро-8-окси-гуаніну, який може нестандартно паруватися з цитозином. Причому у такій парі гуаніловий нуклеотид має конформацію лише анти. За даних умов 8-окси-група знаходиться у великій борозенці ДНК, де може впізнаватися ферментами репарації.

Загальний список деяких з неправильних пар, знайдених у кристалах ДНК та за допомогою ЯМР, представлений у таблиці на слайді 5.