Взаємодія днк з молекулами води

Вода, як відомо, відіграє значну роль у біологічних системах, не в останню роль завдяки вільному формуванню водневих зв’язків з іншими біомолекулами. Молекула води за цим параметром є унікальною, оскільки може бути одночасно як донором, так і акцептором для чотирьох водневих зв’язків з іншими молекулами води або біомолекулами, що призводить до утворення розгалуженої сітки взаємодій, які визначають аномальні властивості даної рідини.

Щодо ДНК, то гідратація цих молекул є необхідною для підтримання їх структурної цілісності та забезпечення функціонування. У даному контексі існує поняття первинної, особливо наближеної гідратної оболонки ДНК, яка являє собою велику групу молекул води, безпосередньо зв’язану з НК і для В-форми ДНК кількість таких водних молекул складає 12-15 на кожен нуклеотид.

Виявлено, що основна маса даної води формує кластери навколо фосфатних груп нуклеотидів, та пов’язана з контр-йонами даних груп – калієм, натрієм, амонієм - для нейтралізації негативного заряду фосфатів. Певна частина молекул води може також поєднуватися з основами нуклеотидів за місцями потенційних місць утворення водневих зв’язків на гранях основ.

Основними методами, які направлені на вивчення положення окремих молекул води навколо ДНК та точної структури гідратної оболонки НК є наступні:

1. ЯМР – особливо придатний для виявлення положення високомобільних молекул води,

2. Кристалографія у кристалах та нитках – вже можлива за роздільної здатності до 1,5 А,

3. Кріокристалографічні методи з використанням Х-синхротронів,

4. Методи молекулярної симуляції.

Завдяки даним методам можна проаналізувати не лише первинну, а також вторинну і навіть третинну гідратні оболонки. У таблиці на слайді 2 представлено відомості щодо отриманих насьогодні кристалічних структур певних послідовностей ДНК, на яких вивчалися принципи формування гідратних та йонних оболонок ДНК.

Завдяки застосуванню вищезазначених методів було виявлено, що структура гідратної оболонки залежить не лише від форми ДНК, а також від виду пар основ у одній формі (А-Т чи Г-Ц), що визначається різницею доступного для гідратації і взаємодії з іншими лігандами у регіонах борозенок. Наприклад, мала борозенка у А/Т-збагачених регіонах є настільки вузькою, що може прийняти всередину лише одну молекулу води на пару основ, якщо говорити про первинну гідратну оболонку.

Разом первинна та вторинна гідратні оболонки, остання з яких являє собою молекули води, що поєднані з ДНК через воду первинної оболонки, формують так званий хребет гідратації або гідратний хребет, який має двовимірну форму. Виявлено, що структура такого хребта залежить від форми ДНК, що визначається зміною орієнтації молекул води відносно фосфатних груп нуклеотидів.

Аналіз розташування водних молекул навколо фосфатних груп у одиничних кристалах усіх трьох канонічних форм дуплексів ДНК показує, що кожен з двох заряджених атомів кисню у фосфатній групі може прийняти на себе до трьох молекул води в результаті гідратації. Атоми кисню, що входять у фосфодиефірний зв’язок, навпроти, майже зовсім не гідратуються.

У А-формі ДНК сусідні фосфати є настільки наближеними один до одного, що молекули води можуть формувати містки між ними. У В-ДНК таких водних містків не виявлено, оскільки групи фосфатів у такій формі є більш просторово розділеними. Атом кисню у складі кільця дезоксирибози часто приймає участь у гідратації, особливо у А-формі. Деякі з октамерних структур А-ДНК мають у районі великої борозенки агрегати молекул води, що складаються з пентагональних, гексагональних та навіть стрічкових сіток водневих зв’язків.

Дуже часто молекули води у складі ДНК є асоційованими з йонами металів, особливо таких як, натрій, кальцій, калій або магній. Такі йони, разом з амонієм, потрібні для нейтралізації негативно заряджених фосфатних груп. Було припущено, що йони натрію можуть приєднуватись до хребта гідратації В-ДНК у районі малої борозенки, можливою є навіть заміна води на йони натрію. Йони магнію, як правило, є гексагідратованими, їх основна роль полягає у наведенні містків між фосфатними групами В-ДНК (слайд 2). Вони також можуть знаходитися у регіони великої борозенки, контактуючи з акцепторами водневих зв’язків на гранях основ та координуючи їх між собою (слайд 3).

Як вже було сказано, ступінь гідратації ДНК визначається її формою структури через різну ширину борозенок. Так, В-ДНК має дуже широку велику борозенку, що включає у себе відносно великі гідрофобні метильні групи тимінів у парах А-Т. Одначе ширини такої борозенки вистачає для формування тривимірної сітки водневих зв’язків навіть у межах первинної гідратної оболонки, причому така сітка контактує одночасно з обома кістяками дуплексу та гранями відповідних основ. Причому молекули води у великій борозенці зв’язані з нею слабкіше, ніж у випадку більш вузької малої борозенки.

Іноді завдяки формуванню зв’язків між декількома молекулами води та пуринами у складі В-ДНК формуються кластери, як показано на слайді 4а, b та c. Піримідинові основи, навпроти, мають, як правило лише одну зв’язану з ними молекулу води, яка може, через ще одну водну молекулу, контактувати з іншою основою.

Вперше детальне вивчення структури гідратного хребта В-ДНК на прикладі дуплексної послідовності d(CGCGAATTCGCG)₂ – так званого експериментального додекамеру Дікінсона-Дрю – було проведено у А/Т-регіоні натрієвої солі даного додекамеру за 1,9 А Дікінсоном та Дрю у 1981 році. Було виявлено, що хребет являє собою лінійне розташування поєднаних водневими зв’язками молекул води, що розповсюджувалось більш ніж на шість пар основ у центральному регіоні малої борозенки, причому кожна з молекул розчинника була також поєднана з акцепторами у складі основ ДНК (слайд 5). Таким чином, кожна з молекул води являла собою місток між сусідніми парами основ. Пізнішими дослідженнями була виявлена присутність також і йонів натрію для стабілізації гідратної оболонки.

У даних дослідженнях було також виявлено, що гідратація малої борозенки В-ДНК має третинну форму, причому кожна парна група молекул води, що складається з двох тріад, формує гідратне ядро гексагональної будови (слайд 4). Таке ядро здате утворювати водневі зв’язки з фосфатними групами. Молекули води у складі таких гексагонів є високомобільними.

Основною проблемою вивчення кристалічних стуктур гідратних оболонок навколо ДНК з залученням контр-йонів є майже рівна кількість електронів у кисню та натрію. Оскільки дифракція Х-променів здійснюється від електронів у атомах, під чам інтерпретації карт електронної щільності можна переплутати кисень, який має 8 електронів, та натрій, який має 10. Ще важче видається ситуація з йонами амонію – на дифракційних картинах його майже неможливо відрізнити від кисню, тому у даному випадку застосовується ЯМР з використанням мітки ₁₅N, так було виявлено, що дані йони локалізуються у районі малої борозенки. З калієм виходить краще, за умови, коли дослідження проводяться за роздільної здатності не менше 2 А.

Загальною картиною структури гідратної оболонки може вважатися динамічна структура з розгалуженими водневими зв’язками, у межах якої відбувається постійна агрегація/дисоціація молекул води, як розчинника, та контр-йонів (йонів амонію та лужних металів)з глибокими (борозенки) та поверхневими (фосфатні групи) сайтами формування воденвих зв’язків на молекулі ДНК. Молекули води у такій структурі, хоча й мають дуже короткий час перебування у одному сайті, все ж прямо відповідають за стабільність будови ДНК у водному розчині та відіграють значну роль у механізмах впізнавання НК з боку білків та інших малих молекул. Контр-йони направлені на підтримання як локальних, так і загальних конформаційних параметрів, наприклад, геометрії згинання А-тракту, як було показано МакКоннелом та Беверіджем у 2000 році.