Малі молекули, що ковалентно приєднуються до днк

Історично першими з відкритих ДНК-зв’язаних антиракових агентів були саме алкілюючі сполуки, що походять з отруйних газів, які використовувалися упродовж Першої світової війни. Такі препарати, так звані нітрогенні гірчичні сполуки, є високотоксичними молекулами. Одначе, їх більш сучасні аналоги, такі як хлорамбуцил, L-фенілаланіновий гірчичний препарат (мельфалан) та циклофосфамід до сих пір використовуються для хіміотерапії ракових захворювань.

Якщо ж говорити загалом про неспецифічне ковалентне приєднання малих молекул до ДНК, то воно, як правило, здійснюється за парами основ, фосфодиефірним кістяком або цукровими залишками. Іноді така ковалентна модифікація є етапом у розрізанні як одного, так і обох ланцюгів ДНК, як, наприклад, за дії антиракових препаратів родини блеоміцину.

Найбільш чутливими до дії агентів нуклеофільної атаки з утворенням ковалентних зв’язків є пуринові основи, серед яких гуанін більш вразливий, ніж аденін. Основними сайтами утворення ковалентних зв’язків на основах є:

1. Атоми О6 гуаніну та N6 аденіну, а також N7 обох пуринів у регіоні великої борозенки,

2. Атоми N1, N2 гуаніну та N3 обох основ у регіоні малої борозенки.

Вибір саме таких сайтів є результатом різного розповсюдження електронної щільності у площині основ, пар основ та послідовностей нуклеотидів. Щодо гірчичних агентів, то їх місце дії зосереджено в основному на атомі N7 гуаніну.

Препарати можуть приєднуватися ковалентними зв’язками до одного або одразу двох сайтів ДНК (якщо вони мають біфункціональні властивості). У останньому випадку можуть утворюватися внутрішньо- та між ланцюгові ковалентні зшивки, що залежить від двох основних факторів:

1. Відстані між двома функціональними групами на молекули препарату,

2. Будови сайту зв’язування на молекулі ДНК, наприклад, має значення, чи знаходяться два прилеглі гуанозини на одному, або ж на різних ланцюгах.

Основні методи, якими вивчаються особливості будови ковалентних комплексів ДНК є використання зондів, а також ЯМР та кристалографія у Х-променях. Щодо останньої, то кристалізація ковалентних комплексів ДНК з малими молекулами є дуже складною процедурою, тому насьогодні добре вивчені у цьому плані лише кристали платинових комплексів з ДНК.

Препарати на основі платини. Найбільш відомим серед таких є цис-дихлородіаміноплатина (ІІ), або, за іншими назвами, цисплатин чи цис-DDP, який насьогодні дуже інтенсивно використовується у хіміотерапевтичних методах лікування раку. Цисплатин є дуже токсичною речовиною, одначе його похідні є, мабуть, одними з найбільш ефективних одиничних агентів у клініці раку, наприклад 90% раку яєчок було вилікувано саме за допомогою цих цисплатину та споріднених до нього сполук.

Показано, що цисплатин приєднується в основному до пуринів у складі ДНК, особливо до гуаніну за атомом N7. При цьому утворюється багато нестандартних структур ДНК, часто з внутрішньоланцюговими зшивками у ділянці d(GG) (слайд 35), та, у меншій мірі, d(AG).

Було отримано ряд кристалічних структур комплексів цисплатину з ДНК, наприклад, на послідовності d(CCTCTG*GTCTCC)•d(GGAGACCAGAGG), де зірочкою вказане місце утворення ковалентної зшивки. У місці зшивки довжина зв’язку між цисплатином та N7 гуанінів складає 2 А, що змінює планарність самих основ і призводить до сильного відхилення структури ДНК від параметрів В-форми у даному регіоні, але не лише у ньому.

Також виявлено, що за умови утворення зшивки дуплекс ДНК значно згинається у бік великої борозенки за місцем цисплатинового сайту. Кут закручування у даному регіоні становить 49⁰ згідно даних ЯМР, але складає менше 26⁰ у кристалічній структурі (слайд 36). Загалом велика борозенка стає компактнішою, а мала – ширшою та мілкішою, ніж у канонічної В-ДНК, збільшуючись у ширині майже на 6 А. Такі зміни структури ДНК дуже схожі на ті, які виникають за умови приєднання до малої борозенки ДНК хромосомних HMG-білків SRY та LEF-1.

Була також отримана унікальна кристалічна структура третинного комплексу, що містив 16-мерний дуплекс ДНК, одну цисплатинову внутрішньоланцюгову зшивку та домен білку HMG1 з 89 амінокислот. У даному комплексі ДНК також зігнута у сторону великої борозенки, але вже на кут близько 61⁰, а мала борозенка у даному регіоні за параметрами нагадує таку у канонічній А-ДНК. Білок-зв’язуючий сайт знаходиться цілком з 3’-сторони по відношенню до приєднаної платини та самого згину ДНК, в той час як білкова частина самого по собі комплексу ДНК-білок розміщується у центрі згину. Така будова дуже нагадує комплекс ДНК-білок у регіоні ТАТА-боксу, про який ми вже говорили.

Одначе у розчині даний комплекс виглядав трохи по-іншому – показано часткове розкручування спіралі у районі зшивки та навіть перехід на лівозакрученість і витіснення цитозинів, що спаровані з зшитими гуанінами, у екстрахеліксний регіон ДНК. У такому випадку платина цілком заходить у малу борозенку.

Було також отримано кристалічну структуру ДНК з платиновою зшивкою на прикладі декамеру d(CCTCG*CTCTC)• d(GAGAG*CGAGG) з однією міжланцюговою 1,2-зшивкою через цисплатин та трохи іншими змінами хеліксних параметрів. Ще більший ступінь змін був виявлений на прикладі 1,3-внутрішньоланцюгових зшивок ДНК у розчині. Так, було зафіксовано втрату парування та витіснення тиміну з хеліксу у районі зшивки.

Серед інших похідних платини (ІІ) та (ІV), що використовуються для лікування раку через введення зшивок у ДНК, можна відмітити:

1. Карбоплатин (цис-діамін-1,1-циклобутандикарбоксилатоплатина),

2. Оксаліплатин ((1R,2R-диаміноциклогексан)оксалатоплатина (ІІ)).

Кристалічна структура комплексу циклогексиламіноплатину (IV) з додекамерним дуплексом ДНК, отримана Сільверманом з колегами у 2002 році, показує, що препарат у комплексі формує асиметричну 1,2-внутрішньоланцюгову зшивку (слайд 36). Всі пари основ у даному регіоні зберігаються, незважаючи на зміну кута закручування через появу зшивки. Подібної будови комплекс з 1,2-внутрішьноланцюговою зшивкою утворюється також за дії оксаліплатину. Різниця між змінами структури ДНК у регіонах 1,2-внутрішньоланцюгових зшивок, утворених на однаковій послідовності ДНК у комплексах з цисплатином та оксиплатином була виявлена за допомогою ЯМР Ву з колегами у 2007 році. Було встановлена невелика зміна кута хеліксного закручування та закручування на рівні пар основ, а також різниця у глобальному згинанні хеліксу. Одначе, аналіз на рівні атомної роздільної здатності провести поки що немає змоги.

Агенти, що поєднують здатність до ковалентних модифікацій з розпізнаванням послідовностей ДНК. Прикладами таких лігандів є антираковий антибіотик СС-1065 (слайд 37), який у своєму складі містить три пірол-індольні одиниці, та його простіший аналог дуокарміцин, що має лише одну. Обидві з даних речовин приєднуються схоже, а саме – один кінець препарату ковалентно зв’язується з атомом N3 аденіну шляхом розмикання циклопропанового кільця. Решта молекули ліганду лежить у малій борозенці ДНК. СС-1065 покриває собою чотири пари основ з 5’-боку даного аденіну та одну пару – з 3’-боку. Така речовина здатна специфічно розпізнавати послідовності типу 5’-AAAAA, причому приєднання ліганду призводить до згину ланцюгів ДНК на 17-22⁰, що дуже схоже на згини натуральних А-трактів та значно наближує молекулу препарату до ДНК.

Менша молекула дуокарміцину індукує менше структурних змін за послідовністю-мішенню, тому ДНК з приєднаним лігандом майже зберігає канонічну В-форму.

Синтетичним аналогом СС-1065 виступає бізелезин, який має достатньо високу експериментальну антиракову активність. Він складається з хімічно активної хлорометильної групи на кожному з кінців молекули та був синтезований для ковалентної взаємодії з послідовністю 5’-TAATTA. У даному регіоні за умов розчину через високе значення кута пропелерного вигину у районі А-Т пар спостерігається значна зігнутість ланцюгів ДНК після приєднання ліганду.

Дослідження за допомогою ЯМР показало дві альтернативні структури даного комплексу у співвідношенні 40:60 – обидві мали прямі А-тракти у своїй основі, але різниця була у розміщенні водневих зв’язків навколо центральних А-Т пар: перша структура була взагалі неспарена у даному регіоні, а у другій виявлялася пара Хугстіна.

Алкілування за малою борозенкою, як правило, здійснюється через атом N2 гуаніну. Серед речовин, що приєднуються до ДНК саме так і також мають певну антиканцерну активність, варто відмітити наступні:

1. Родина піроло[2,1-с][1,4]бензодіазепіну (PDB) – відносяться до натуральних антиканцерних лігандів ДНК. Яскравим прикладом є антибіотик антраміцин, який ковалентно зв’язується з екзоциклічним атомом N2 гуаніну за місцем власного подвійного зв’язку N10-С11 (слайд 38 зверху). Була отримана кристалічна структура комплексу між ДНК та димером такого ліганду (слайд 39), у якому кожна з молекул препарату лежить у малій борозенці, що дуже схоже на механізм не ковалентного приєднання беренілу або нетопсину, розглянутий нами раніше. Сайт приєднання антраміцину складає 3 пари основ та, як правило, має будову 5’-Pu-G-Pu.

2. DSB-120 та його аналоги, димери діазепінової будови – здатні приєднуватися до малої борозенки В-ДНК майже не змінюючи її канонічної структури, що, таким чином, не викликає активації ферментів репарації. Сам DSB-120 (слайд 38 знизу) є надзвичайно цитотоксичною речовиною, його ІС₅₀ складає 0,0005 μМ, що приблизно в 1000 разів перевищує подібну характеристику мономеру. Такі вбивчі ефекти реалізуються, скоріше за все, внаслідок інгібування транскрипції. Сайт приєднання DSB-120 складає 6-7 пар основ, з спорідненістю до послідовностей виду 5’-Pu-GATC-Py. В результаті взаємодії даного ліганду з ДНК утворюються перехресні ковалентні міжланцюгові зшивки у двох регіонах малої борозенки, при цьому спостерігається майже ідеальна ізохелікальність, що призводить до дуже міцного зв’язування з В-ДНК. За допомогою ЯМР було виявлено, що таке зв’язування майже не призводить до порушення структури ДНК, тому не активує репараційну машинерію клітини. Одним з недавно синтезованих та найбільш активних похідних DSB-120 є SJG-131, який за даними 2004 року згідно Елі з колегами уже почав проходити клінічні тести.

3. Мітоміцин – був відкритий у Японії у складі залишків бродильних екстрактів ще більш ніж 50 років тому, та через високу токсичність лише частково використовувався для лікування твердих пухлин. Одним з яскравих представників родини є мітоміцин С, який потребує попередньої метаболічної активації для взаємодії з ДНК. Сама молекула ліганду у ході такої взаємодії приєднується одним ковалентним зв’язком до гуаніну у послідовності 5’-CpG через відкриття власного азіридинового кільця (слайд 39). Другий зв’язок формується через карбаматну групу з іншим гуаніном. Було охарактеризовано ряд структур такого комплексу за допомогою ЯМР, що визначило майже повну відсутність змін у В-ДНК після приєдання ліганду та виявило розміщення молекули препарату всередині великої борозенки ДНК.

Нарешті, у таблиці на слайді 40 зведено дані щодо отриманих насьогодні кристалічних структур ковалентних комплексів ДНК з малими молекулами, в основному з тими, що містять платину.