Визначення послідовності нуклеотидів днк

Першим кроком для характеристики нуклеїнової кислоти є визначення послідовності (сиквенсу) її нуклеотидів. Природні подвійно ланцюгові ДНК, як правило, дуже довгі для здійснення сиквенсу, тому визначення йде через так званий маппінг - детермінацію позицій фрагментів певної довжини у складі дослідної ДНК. Така детермінація включає в себе поєднання як хімічних, так і ензиматичних методів, причому таким чином можна секвенсувати як природні, так і хімічно синтезовані НК.

Хімічний сиквенс ДНК за методом Максама-Гілберта. Основою методу є використання хімічних реакцій, специфічних до певних азотистих основ, для розщеплення полінуклеотидів у місцях знаходження кожної з чотирьох основ – А, Г, Ц або Т. Полінуклеотид, який секвенсують, мітиться за допомогою радіоактивного фосфору (³²Р) за 5’- або 3’кінцем, потім обробляється осново-специфічним реагентом (наприклад, для Г) так, що менш ніж 1% гуаніну у складі НК вступає у реакцію. Подальша обробка хімічно-модифікованого полінуклеотида спричиняє розщеплення саме за місцем кожного з модифікованих Г. Таке розщеплення призводить до появи набору мічених за кінцями фрагментів, чиї довжини показують позиції кожного з гуанінів у послідовності; у подальшому точні довжини (до одного нуклеотиду) таких фрагментів визначаються за допомогою гель-електрофорезу. Зрозуміло, що така реакція продукує і багато інших фрагментів, але визначаються лише мічені за кінцями. Таким чином, здійснюючи чотири окремі експерименти з використанням реагентів на кожну основу, можна визначити положення кожної з основ на нуклеотидах по відношенню до міченого кінця.

Реакції за Максамом-Гілбертом мають ряд загальних характеристик:

1. Осново-специфічна реакція атакує як правило два зв’язки – або зв’язок у складі ароматичного кільця основи, або глікозидний зв’язок.

2. Перший крок реакції дестабілізує кільце дезоксирибози та робить його готовим до атаки такими агентами, як піперидин, що дозволяє розщеплювати дане кільце між атомами О та С1’.

3. Перебудова отриманого у результаті розщеплення альдегіду (С=О) на атомі С1’ на групу С=N дестабілізує кільце дезоксирибози за процесом, названим β-елімінацією. Така елімінація призводить до розщеплення зв’язків С5’-О та С3’-О.

4. В результаті відбувається конверсія фосфодиефірів на фосфомоноефіри: 5’-фрагмент ланцюга переривається на 3’-фосфаті, а 3’-фрагмент починається з 5’-кінцевого фосфату.

Для специфічних реакцій на основи використовують:

1. Для Г + А піперидин у кислій формі,

2. Для Г диметилсульфат + піперидин у основній формі,

3. Для Ц + Т гідразин + піперидин у основній формі,

4. Для Ц гідразин у 1,5М NaCl + піперидин у основній формі.

Сам механізм реакції представлений на слайдах 7 (специфічний до Г + А), 8 (специфічний до Г) та 9 (специфічний до Ц + Т).

Коротко розглянемо кожен з варіантів:

А) Реакція Г + А починається з кислотної депуринізації (рН = 2), яка, як правило, не зачіпає піримідинові основи, та відбувається наступним чином. Протонування атому N7 призводить до утворення резонансної структури з позитивним зарядом на N9. Спорідненість N9 до електронів дестабілізує глікозидний зв’язок, який атакується водою за атомом С1’. Відбувається власне апуринізація, (крок 1, слайд 7).

Після звільнення від пуринової основи кільце рибози може розімкнутися та відкрити альдегід біля С1’ для реакції з піперидином (крок 2). У результаті цього утворюється основа Шиффа, яка призводить до відщеплення протона від 2’-положення через збільшення його кислотних властивостей. Даний протон переходить на піперидин, який у даній парі діє у якості основи.

Такі події призводять до формування подвійного зв’язку між атомами С2’ та С3’ та відщепленню 3’-фосфатної групи у якості аніону у процесі β-елімінації, причому фосфат залишається приєднаним до 5’-кінця наступного нуклеотиду послідовності (крок3).

Далі піперидином забирається ще один протон, вже біля 4’-положення, і процес елімінації повторюється, на цей раз з втратою уже 5’-кінцевої фосфатної групи зі збереженням її місця на 3’-кінці попереднього нуклеотиду послідовності (крок 4).

Загальним результатом даних подій є розрив ланцюга на два коротших зі збереженням 3’- та 5’-кінцевих фосфатних груп, а також елімінації дезоксирибозного фрагменту, що походить з апуринізованого нуклеотиду А або Г. Зверніть увагу на те, що у даному випадку ні один зв’язок С-С кістяку ДНК не розривається.

Утворення кінцевих фосфатів на фрагментах є дуже важливою характеристичною ознакою розглянутого метода. Наприклад, відсутність однієї з двох реакцій елімінації призвела б до утворення фосфодиефіру на кінці одного з ланцюгів замість фосфату, а електрофоретична мобільність такої структури є значно зниженою у порівнянні з ланцюгом з фосфомоноестером на кінці. Такий факт пояснюється тим, що фосфодиефір має лише один негативний заряд, а не два, як у простого фосфату. До того ж, збільшення величини молекули за рахунок фосфодиефіру та додаткового дезоксирибозного кільця на кінці ланцюга, додає фрикційного опору під час руху у електричному полі.

Б) Реакція, специфічна до Г, включає в себе метилування гуаніну диметилсульфатом за атомом N7 (крок 1, слайд 8).

Інші основи також метилуються, але на наступному кроці додавання піперидину (рН = 8) розщеплює ланцюг лише у місці розташування метильованого Г. Такий Г далі піддається розкриттю кільця основи шляхом атаки на С8 з боку ОН^- (крок 2).

Далі піперидин заміщує глікозидний зв’язок у нуклеотиді, потім йде розрив зв’язку С1’-О та вже відома нам β-елімінація, яка веде до утворення 5’- та 3’-фосфатних ланцюгів.

В) Нарешті, реакція Ц + Т починається з підведення гідразину до подвійного зв’язку між атомами 5 та 6 основи, далі гідразин атакує С4-карбоніл, що закінчується утворенням з основи нового п’ятичленного кільця (крок 1, слайд 9). Таке кільце спонтанно деградує, розмикаючись.

У процесі кроку 2 елімінація п’ятичленного кільця супроводжується розщепленням дезоксирибози за зв’язком С1’-О. Далі стадія β-елімінації дає ланцюги з 3’- та 5’-кінцевими фосфатами.

Реакція, специфічна лише до Ц, відрізняється від попередньої лише тим, що до середовища додають NaCl для зміщення специфічності реакції у бік Ц.

Після проведення кожної з даних реакцій, отримані аліквоти завантажуються у поліакриламідний гель та піддаються електрофорезу. Сама послідовність ДНК читається з отриманих характерних секвентальних драбинок, які візуалізуються за допомогою мітки та фотографічної плівки або люмінесцентних пластинок.

Сиквенс ДНК за методом Сенгера. Логіка даного методу схожа на попередній – обрив ланцюга в місті розташування нуклеотиду певного типу з утворенням продуктів з міченими кінцями. Але, на відміну від використання хімічних агентів, у даному випадку здійснюється синтез комплементарної послідовності ДНК. Невелика фракція одного з типів дідезоксинуклеотидтрифосфату (наприклад, дідезоксигуанозинтрифосфат, ddGTP) використовується для термі нації синтезу такої послідовності. Візуалізація та визначення довжин отриманих фрагментів з міченими кінцями здійснюються за допомогою електрофорезу.

Синтез ДНК у даному випадку проходить з використанням ДНК-полімерази, яка потребує праймера (комплементарного олігонуклеотиду з вільним 3’-кінцем) для початку синтезу. Таким чином, у якості матриці може бути використана як одно- так і подвійноланцюгова ДНК, праймер визначає, який саме ланцюг та який його регіон будуть піддані сіквенсу. Поряд з вищенаведеним термінуючим нуклеотидом до середовища додається повний набір нуклеозидтрифосфатів для синтезу. Термінуючий дідезоксинуклеотид не має гідроксилу в 3’-положенні, тому не може приєднати наступний мономер, таким чином, за його інкорпорації синтез ланцюга зупиняється.

Новосинтезовані ланцюги, отримані з реакцій з усіма чотирма дідезоксинуклеотидами, можуть мітитися радіоактивно та розганятися за допомогою електрофорезу, який також дає секвентальні драбинки. Альтернативним варіантом є мічення кінцевого термінуючого нуклеотиду різною флуоресцентною міткою (для кожного з чотирьох варіантів нуклеотидів - своя мітка). При цьому можна провести всі чотири типи реакцій у одному середовищі та отримати лише одну секвентальну драбину. У такому разі кожен «щабель» такої драбинки ідентифікується за допомогою характеристичного максимуму флуоресценції дідезоксинуклеотиду. Можна також сканувати отриману послідовність лазером або іншими детекторами.

Хоча такий метод сиквенсу є дуже розповсюдженим, він має свої недоліки. Основний з них – труднощі сиквенсу послідовностей, багатих на ГЦ-пари. Це пояснюється зміною електрофоретичної рухливості таких ланцюгів через більшу кількість водневих зв’язків між ними, що призводить до компресії та перекривання фракцій на електрофореграмах. Виходом з даного становища є заміна гуанозинмонофосфату на інозинмонофосфат під час реакції полімеризації для зменшення кількості пар, або ж використання вищих температур під час електрофорезу.