Необходимое оборудование:

• Амплификатор (термоциклер).

• ПЦР-бокс или отдельный стол, освещаемый УФ-лампой.

• Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

• Штативы для микропробирок на 0,5 cм3.

• Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 cм3.

• Одноразовые наконечники для микропипеток.

• Морозильник на минус 20°С для хранения реактивов и выделенных ДНК.

• Охладитель проб или ледяная баня.

• Термостат для микропробирок на 85°С.

• Отдельный халат и одноразовые перчатки.

Порядок работы:

1. Разморозить все реактивы из набора, кроме Taq-полимеразы, перемешать переворачивая и поместить в охладитель проб или ледяную баню. Пробирку с воском прогреть в термостате при 85°С до полного расплавления.

2. Приготовить «нижнюю» реакционную смесь для исследуемого N(количество проб), включая контроли, для этого в отдельной пробирке смешать:

• 5 мкл деионизованной воды N,

• 5 мкл смеси нуклеотидтрифосфатов N,

• 5 мкл праймеров N,

перемешать.

3. Раскапать в микропробирки для ПЦР по 15 мкл, наслоить сверху по 15 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрыть крышки пробирок и подписать на каждой название инфекции (в таком виде пробирки хранятся в морозильнике несколько месяцев до использования, поэтому можно приготовить сразу 100 штук).

4. Приготовить «верхнюю» реакционную смесь на исследуемое N, включая контроли, для этого смешать в отдельной пробирке:

• 10 мкл 5-кратного реакционного буфера N,

• 14 мкл деионизованной воды N,

• 1 мкл Taq-полимеразы N,

перемешать, осадить на центрифуге и раскапать по 25 мкл в пробирки на поверхность застывшего воска.

5. Раскапать по две капли минерального масла.

6. Внести под масло по 10 мкл ДНК, выделенной из проб и по одной пробирке контрольной ДНК (ДНК+ и ДНК-).

7. Запустить на амплификаторе следующую программу:

95°C – 1 мин

95°С – 1 мин,

65°С – 1 мин, 40 циклов

72°С – 1 мин,

10°С – 24 часа.

Когда температура в амплификаторе достигнет 95°С, поставить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и ждать окончания реакции (примерно 2,5 часа).

8. После окончания реакции собрать пробирки в отдельный пакет и отправить в комнату для анализа продуктов ПЦР. Анализ продуктов амплификации проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.

5.3. Этап 3. Электрофоретический анализ продуктов амплификации

ВНИМАНИЕ!!!

Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате, лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении(Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Ветеринария, 1997, № 7).

Необходимое оборудование:

• Камера для горизонтального электрофореза в агарозном геле.

• Источник постоянного тока (100, 150 В).

• Ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей.

• Фотоаппарат для фотографирования гелей.

• Холодильник на 4°С для хранения продуктов амплификации.

• Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

• Мерный цилиндр на 1000 см³и емкость на 2000 см³.

• Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы.

• Электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.

• Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

• Набор для проведения электрофоретического анализа продуктов ПЦР.