Kompendium_po_biofizike_1

ФОРМИРОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ КЛЕТКИ В ПОКОЕ И ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ

1. История открытия биопотенциалов. Гипотеза Бернштейна.

Одим из первых шагов на пути выяснения природы электрических явлений в живых организмах («животного электричества») был сделан тогда, когда французский священник аббат Нолле в 1746 году открыл явление осмоса. В то далекое время явление осмоса рассматривалось как результат действия неких особых, так называемых «жизненных» сил, которые действуют только в живых организмах2. В 1826 году французский врач и физиолог А. Дютроше заинтересовался явлением осмоса. Он был первым исследователем, кто научно доказал, что осмос есть результат проявления не особых, мифических «жизненных» сил, а законов физики и химии. С этого момента сторонники физико-химического подхода в биологии начали многочисленные исследования проявления осмоса в живых организмах. Осмосом начали объяснять работу почек, всасывание пищи в кишечнике.

В исследовании осмоса главную роль сыграли ботаники – они были первыми, кто начал изучать живые организмы, как теперь говорят, на клеточном уровне. Немецкий ботаник Пфеффер сделал важный и принципиальный шаг в исследовании осмоса – изобрел осмометр и измерил величину осмотического давления. Измеряя величину осмотического давления для разных растворов, Пфеффер обнаружил, что для каждого раствора величина давления прямо пропорциональна концентрации растворенного в растворителе вещества, не проходящего через

полупроницаемую мембрану ( Росм ~	m	, где m – масса
V

растворенного вещества, V – объем раствора). Однако исследователь не смог объяснить, почему для разных растворов при одной и той же массовой концентрации получаются разные давления.

2 Явление осмоса первоначально обнаружили и изучали на полупроницаемых пленках животного происхождения (стеки мочевого пузыря, кожа лягушки и т.д.).

101

В 70-х года XIX века голландский ботаник Х. Де Фриз3 занимался явлением осмоса – изучал влияние осмоса на изменение объема клеток растений в растворах разной концентрации. Х. Де Фриз рассказал о работах Пфеффера по исследованию осмоса молодому голландскому химику Я. ВантГоффу. Изучив экспериментальный материал Пфеффера, ВантГофф пришел к заключению, что молекулы растворенного вещества в растворителе ведут себе подобно молекулам идеального газа. Следовательно, величину осмотического давления можно рассчитать по формуле для определения давления идеального газа:

Pосм См RT

где СМ – молярная плотность растворенного вещества. За теорию растворов Вант-Гофф через 15 лет получит Нобелевскую премию по химии.

Теория Вант-Гоффа давала точные значения величины осмотического давления для растворов многих веществ (сахарозы, СО2). Но для некоторых веществ величина осмотического давления оказывалась больше расчетной в 2 раза. Вряд ли такую высокую погрешность (100%) можно объяснить неточностью измерений. Обдумывание данной проблемы привело к важнейшему открытию. Единомышленник Вант-Гоффа шведский ученый С. Аррениус предположил, что если, например, для раствора NaCl давление оказывается в два раза больше расчетного, то это может означать лишь одно – в растворе число частиц увеличивается вдвое. Увеличение вдвое числа части в растворе натолкнуло на мысль, что в растворе молекула поваренной соли распадается на две частицы. Из сопоставления этого факта с другими (например, сравнивая электропроводность раствора) Аррениус пришел к идее электролитической диссоциации. До Аррениуса считалось, что ионы в растворах возникают при действии на раствор электрического тока. Однако участие ионов в явлении осмоса показало, что это не соответствует действительности – ионы существуют в растворах некоторых веществ до пропускания через них электрического

3 Впоследствии Х. Де Фриз стал одним из создателей современной ботаники, был ректором Амстердамского университета.

102

тока. Таким образом, изучение осмоса привело к открытию двух объектов, имеющих самое непосредственное отношение к «животному электричеству» − полупроницаемых мембран и ионов.

В 1887 году в первом номере «Журнала физической химии»4 была опубликована статья Вант-Гоффа и Аррениуса с изложением теории электролитической диссоциации. Статья в журнале возвещала научному миру о новом подходе в химии. В Берлине в 1887 году окончил университет Вальтер Нернст (23 года). Впоследствии он станет знаменитым физиком и химиком,

откроет третье начало термодинамики, получит Нобелевскую премию по химии, сменит на посту Института физики в Берлине знаменитого

Макса Планка.

По окончании университета В. Нернст работал в

		должности ассистента
	Рисунок 37. Опыт Нернста
		Оствальда и темой

своей диссертации он выбрал теоретическую работу о гальванических элементах. Теорией гальванических элементов до Нернста занимались такие великие ученые, как У. Томсон, Гиббс, Гельмгольц. Но Нернст решил разработать новую теорию гальванических элементов, исходя из того, что в электролитах существуют ионы, способные к диффузии. В 1889 году диссертация была завершена Нернстом и опубликована. В ней, в частности, была высказана и обоснована идея так называемого диффузионного потенциала, возникающего при соприкосновении двух жидкостей.

Кратко рассмотрим механизм возникновения диффузионного потенциала. Пусть имеется сосуд с непроницаемой перегородкой. По обе стороны перегородки в сосуде находится электролит

4 Основателем журнала был знаменитый ученый В. Оствальд

103

Рисунок 38. Диффузия ионов через полупроницаемую плѐнку

различной концентрации. Пусть, например, концентрация электролита слева от перегородки будет больше, чем в правой части сосуда (см. рисунок 37). После того как из сосуда будет изъята перегородка, в сосуде начнется процесс диффузии, стремящийся выровнять концентрации ионов электролита в левой и правой частях сосуда. А так как концентрация

электролита в левой части изначально более высокая, то преобладающими будут потоки ионов из левой части сосуда в правую. Если предположить, что

скорость	движения
положительных	и
отрицательных	ионов
разная	(разная

подвижность ионов), то более быстрые ионы (например, отрицательные)

убегут вперед от более медленных ионов положительных ионов. Возникнет расслаивание катионов и анионов в растворе, вследствие чего в растворе образуется электрическое поле с разностью потенциалов, получившей название диффузионного потенциала. Величина диффузионного потенциала, согласно Нернсту, может быть рассчитана по формуле:

	u		RT	ln	C1	,
н	u		F		C2

где u и – скорости более быстрого и более медленного ионов, R – универсальная газовая постоянная, T – температура раствора, F – постоянная Фарадея, C1 и C2 – концентрации электролита в левой и правой частях сосуда.

Таким образом, для возникновения диффузионного потенциала необходимыми условиями являются: а) разность концентраций электролита, различная подвижность анионов и катионов.

104

В 1890 году Вильгельм Оствальд, продолжая исследования полупроницаемых искусственных пленок, установил, что полупроницаемость пленок может вызвать не только осмос, но и электрические явления. Осмос возникает тогда, когда пленка пропускает относительно мелкие молекулы растворителя (например, воды), но не пропускает крупные молекулы растворенного вещества. Но ведь в электролите ионы могут иметь разные размеры. Если взять сосуд, разделить полупроницаемой пленкой на две части, в левую и правую части сосуда залить электролит разной концентрации, и если размеры пор в пленке позволяют проникать через нее только относительно мелким ионам, например, отрицательным ионам (см. рисунок 38), то вследствие диффузии между левой и правой половинами сосуда возникнет разность потенциалов. Величина разности потенциалов определяется из формулы В.Нернста (если предположить, что скорость одного сорта ионов равна нулю – мембрана не пропускает данный сорт ионов):

	RT	ln	C1	.
н
	F		C2

Таким образом, В.Оствальд объединил знания о полупроницаемых мембранах с формулой Нернста. Он предположил, что свойствами полупроницаемой мембраны можно объяснить потенциалы мышц, нервов, электрических органов рыб. Идея Оствальда, как ни странно, оказалась незамеченной ни биологами, ни физиологами. И только Юлиус Бернштейн смог ее оценить.

Бернштейн не только оценил идею Оствальда, но и сделал следующий решающий шаг на пути выяснения природы электричества в живых организмах. Он начал объяснять электрические свойства мышц и нервов не устройством этих органов в целом, а свойствами клеток, из которых эти органы состояли. Бернштейн был первым, кто указал на непосредственного «виновника» «животного электричества» − клеточную мембрану и перенос ионов.

Первые публикации Ю. Бернштейна по мембранной теории потенциалов появились в далеком 1902 году. 1902 год

105

по праву считается годом рождения мембранной теории биопотенциалов.

Согласно гипотезе Бернштейна, каждая клетка имеет оболочку, которая представляет собой полупроницаемую мембрану. Внутри и вне клетки имеются много свободных ионов, среди которых находятся ионы К+. Пусть концентрация ионов К+ внутри больше, чем вне клетки, и клеточная мембрана пропускает только ионы К+. Тогда ионы К+ начнут выходить из клетки, где их много, наружу. Одновременно с этим существует поток ионов К+ снаружи клетки внутрь, но так как снаружи ионов К+ мало, то и поток этот будет незначительный на фоне потока ионов К+, направленного изнутри клетки наружу. Вместе с ионами К+ наружу будет выноситься и положительный заряд. Поэтому на внутренней стороне мембраны клетки, находящейся в состоянии покоя, образуется скомпенсированный отрицательный электрический заряд, а на наружной стороне – положительный. Возникающая разность потенциалов будет тормозить вынос ионов К+ из клетки и увеличивать поток ионов К+ снаружи клетки внутрь клетки. Когда потоки ионов внутрь клетки и наружу сравняются, установится на клетке динамическое равновесие и на клеточной мембране будет поддерживаться постоянным по величине потенциал покоя. Разность потенциалов между внутренней стороной БМ и ее наружной стороной называется потенциалом покоя (ПП). Величина ПП описывается формулой Нернста:

	RT	ln	K	i
					,
н	F		K
				0

где K i − концентрация ионов калия внутри клетки, K 0 −

концентрация ионов калия снаружи клетки.

Гипотеза Бернштейна о генерации ПП на клеточной мембране была встречена в научном мире без особого восторга и оваций. В глазах современников она выглядела не более чем гипотезой и самому Бернштейну, а затем и его последователям, понадобились годы и десятилетия упорного труда, споров и сомнений, пока удалось доказать свою правоту. В первую очередь гипотеза требовала экспериментальных подтверждений.

106

Бернштейну пришлось придумать серию научных экспериментов, которые могли бы, пусть даже и косвенно, подтвердить его теорию.

Таким образом, за открытием природы электрических явлений в живых организмах видится многолетний труд ученых разных направлений:

ботаников – измеривших осмотическое давление; физиков – открывших электрические заряды и

электрические и газовые законы; химиков – создавших теории растворов и

электролитической диссоциации; математиков – труды, которых позволили создать

дифференциальное и интегральное исчисление.

2. Мембранно-ионная теория генерации биопотенциалов клеткой и основные опыты, еѐ подтверждающие

Свою первую статью с изложением взглядов на происхождение электричества в живых организмах Ю. Бернштейн опубликовал только после того, как придумал ряд экспериментов ее подтверждающих. Ученый провел серию эффектных опытов на неповрежденной мышце лягушки. Он показал, что, если нагреть один конец целой неповрежденной мышцы, от нагретого участка к холодному участку поверхности мышцы потечет ток. Этот результат прямо следовал из формулы Нернста – в более теплом месте поверхности возникает больший электрический потенциал, чем в холодном. Электрический ток течет по направлению от точек пространства с более высоким потенциалом к месту с более низким значением электрического потенциала.

Некоторое время слабым местом в теории Бернштейна было отсутствие данных о том, какой именно ион создает ПП. В 1905 году молодой сотрудник В. Нернста5 Гебер обнаружил, что все соли, содержащие калий, оказывают на мышцу схожее действие: участок мышцы, на который действовал раствор соли калия,

5 В. Нернст в это время занимал пост директора Института физики в Берлине.

107

приобретал отрицательный потенциал по отношению к другим участкам мышцы. Бернштейн сразу оценил работы Гебера как подтверждение его теории. Все соли калия при диссоциации в воде повышали наружную концентрацию ионов калия, при этом

отношение	K	i	уменьшается, соответственно, уменьшается и
	K	0

потенциал той области мышцы, на которую действуют соли калия. В результате электрический ток тек по поверхности неповрежденной мышцы по направлению к участку, содержащему повышенную концентрацию ионов калия.

Однако эксперименты Бернштейна и Гебера были лишь косвенным подтверждением мембранной гипотезы о происхождении электрических потенциалов в живых организмах. Они не вызвали особого восторга в ученом мире, и это было предсказуемо и закономерно. Так, влияние температуры на величину потенциала можно было объяснить ускорением химических реакций. Влияние калия на величину ПП также могло быть истолковано как результат химического взаимодействия солей калия с веществом клетки. Чтобы подтвердить правильность гипотезы, требовалось доказать следующее:

клетки имеют мембрану, которая проницаема лишь для одного иона (или нескольких ионов);

концентрация этого ионов (этих ионов) по обе стороны БМ различная;

потенциал на мембране возникает только за счет проницаемости мембраны для этого иона (этих ионов) и он равен нернстовскому потенциалу.

Из трех китов, на которых покоилась мембранная теория Бернштейна, мембрана, внутриклеточная среда и наружный раствор, – в тот исторический момент6 наиболее изученной была наружная среда клетки. Гораздо сложнее было определить ионный состав внутриклеточной жидкости. Тем более что

6 Здесь будет уместным вспомнить тот факт, что в то далекое время о клеточных мембранах ученые знали слишком мало – в 1902 году ученый Овертон на основании того, что в клетку легко проникают вещества, растворимые в липидах, предположил, что клеточная мембран содержит в своем составе липиды.

108

исследователям требовалось доказать не только существование калия во внутриклеточной жидкости, но и то, что калий находится внутри клетки в состоянии свободных ионов. Решить эту проблему удалось только тогда, когда был освоена технология изготовления стеклянных микроэлектродов, с помощью которых можно было проникнуть внутрь клетки, и когда была обнаружена гигантская клетка.

В1936 году англичанин Дж. Юнг, специалист по головоногим моллюскам, обнаружил кальмара, у которого диаметр нервного волокна доходил до миллиметра. Нервное волокно – это клетка, и по клеточным масштабам аксон кальмара был гигантской клеткой, хотя сам моллюск вовсе не был гигантом. Нервное волокно кальмара, будучи выделенным из организма моллюска и помещенное в морскую воду, не погибало. Впервые ученые получили возможность проводить эксперименты на клеточном уровне.

В1939 году английские ученые А. Ходжкин и его ученик А. Хаксли измерили разность потенциалов на аксоне кальмара. Им удалось также доказать, что внутри аксона кальмара имеется много ионов калия и ионы калия образуют своеобразный ионный газ, т.е. находятся в свободном состоянии.

3. Потенциал покоя. Уравнение Нернста. Уравнение Гольдмана-Ходжкина-Катца

Потенциал покоя (ПП, мембранный потенциал покоя). ПП называется разность потенциалов между внутренней и наружной сторонами клеточной мембраны, возникающей в состоянии покоя клетки. У живых клеток в покое между внутренним содержимым клетки и наружным раствором существует отрицательная разность потенциалов (ПП) порядка 60–90 мВ, которая локализована на поверхностной мембране. Внутренняя сторона мембраны заряжена электроотрицательно по отношению к наружной. ПП обусловлен избирательной проницаемостью покоящейся мембраны для ионов К+ (Ю. Бернштейн, 1902, 1912; А. Ходжкин и Б. Катц, 1947).

109

Предположим, что клетку с мембраной, проницаемой только для ионов калия, поместили в электролит, где их концентрация меньше, чем внутри клетки. Сразу после соприкосновения мембраны с раствором ионы калия начнут выходить из клетки наружу, как выходит газ из надутого шара. Но каждый ион несет с собой положительный электрический заряд, и чем больше ионов калия покинет клетку, тем более электроотрицательным станет ее содержимое. Поэтому на каждый ион калия, выходящий из клетки, будет действовать электрическая сила, препятствующая его движению наружу. В конце концов, установится равновесие, при котором электрическая сила, действующая на ион калия в канале мембраны, будет равна силе, обусловленной различием концентраций ионов калия внутри и вне клетки. Очевидно, что в результате такого равновесия между внутренним и наружным растворами появится разность потенциалов. При этом, если за нуль потенциала принять потенциал внешнего раствора, то потенциал внутри клетки будет отрицательным. Эта разность потенциалов – самое простое из наблюдаемых биоэлектрических явлений – носит название «потенциал покоя» клетки. В первом приближении величину ПП можно рассчитать с помощью формулы Нернста:

		RT		K	,
			ln	i
	н	F		K
				0

где K i − концентрация ионов калия внутри клетки, K 0 −

концентрация ионов калия снаружи клетки.

Подставляя численные значения в формулу Нернста, получим значение ПП порядка –87 мВ, что весьма близко к экспериментально измеренному значению ПП. Дальнейшие исследования показали, что вклад в формирование ПП вносят не только ионы калия, но и ионы натрия и хлора.

Концентрация К+ в протоплазме примерно в 50 раз выше, чем во внеклеточной жидкости, поэтому, диффундируя из клетки, ионы выносят на наружную сторону мембраны положительные заряды, при этом внутренняя сторона мембраны, практически не проницаемой для крупных органических анионов, приобретает отрицательный потенциал. Поскольку проницаемость мембраны в покое для Na+ примерно в 100 раз ниже, чем для К+, диффузия

110