3.4. Интегральная форма уравнения Михаэлиса-Ментен

Значительным недостатком классической исходной формы уравнения Михаэлиса-Ментен (3.10) является необходимость сбора огромного массива экспериментальных данных для определения кинетических характеристик ферментативных процессов. Альтернативой, позволяющей определить кинетические характеристики ферментативной реакций при минимальном количестве экспериментов, является интегральная форма уравнения Михаэлиса-Ментен. Исходное уравнение Михаэлиса-Ментен может быть представлена следующим образом:

;

;

.

Проведём интегрирование уравнения:

;

;

. (3.13)

Уравнение (3.13) представляет собой интегральную форму уравнения Михаэлиса-Ментен. Для данного уравнения (3.13) можно предложить преобразование:

, (3.14)

. (3.15)

Линейные преобразования (3.14) и (3.15) графически представляются прямой с углом наклона tgα = K_S (рис.3.6).

Рис.3.6. Линеаризация зависимости, описываемой интегральной формой уравнения Михаэлиса-Ментен

3.5. Ингибирование ферментативных реакций

Скорость ферментативных реакций может быть частично снижена или полностью заблокирована определёнными соединениями. Вещества, подавляющие каталитическую активность ферментов, называют ингибиторами. Также активность многих ферментов тормозиться избытком субстрата.

Ингибитор способен к образованию комплекса с ферментом, но не может быть подвергнут каталитическому превращению и препятствует образованию комплекса фермент–субстрат. Инактивация фермента предполагает либо необратимое связывание фермента с отравляющими фермент веществами, либо разрушение структуры фермента под действием физико-химических параметров. В отличие от обратимого ингибирования, при инактивации активность фермента уменьшается во времени.

Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов изучения специфичности действия ферментов и расшифровки механизма их действия.

Основные типы ингибирования ферментных реакций, а также ряд других типичных для ферментативных реакций процессов, представлены в таблице 3.1.

Таблица 3.1.

Кинетические схемы, основные формулы различных ферментативных процессов

Кинетическая схема	Основные формулы	Графическое решение
Ингибирование фермента
Однокомпонентное ингибирование фермента
Однокомпонентное полностью конкурентное ингибирование фермента
	–константа диссоциации комплекса EJ	Рис. 3.7.(а, б) Анализ в координатах Диксона (1/r=f([J])): рис. 3.7 (в)

Однокомпонентное полностью неконкурентное ингибирование фермента
[S]>>[E]		Рис. 3.8.(а, б) Анализ в координатах Диксона (1/r=f([J])): рис. 3.8 (в)
Двухкомпонентное ингибирование фермента
Двухкомпонентное полностью конкурентное ингибирование фермента
Двухкомпонентное взаимозависимое полностью конкурентное ингибирование фермента
	; ; .	Рис. 3.9

Двухкомпонентное взаимонезависимое полностью конкурентное ингибирование фермента
	; ; .
Двухкомпонентное полностью неконкурентное ингибирование фермента
Двухкомпонентное взаимонезависимое полностью неконкурентное ингибирование фермента
	; .	Рис.3.10

Ингибирование фермента высокими концентрациями субстрата
	ES2 – неактивный комплекс Если низкие концентрации [S]: Если высокие концентрации [S]:	Рис. 3.11 а – в общем виде; б – высокие концентрации субстрата
Ингибирование фермента продуктом (продукт ингибирует фермент по полностью конкурентному типу)
		Рис. 3.12

Обратимая изомеризация фермента в неактивную форму
	–константа равновесия [S] высокая [S] низкая
Необратимая инактивация фермента
Необратимая инактивация фермента в свободном виде
	kин – константа скорости	Рис. 3.13

	Необратимая инактивация фермента в составе фермент-субстратного комплекса

		Рис. 3.14
Влияние кислотности среды на кинетику ферментных реакций
	; ; ; ; [H^+]>>Kв [H^+] << Kа [H^+] ≈ Kа, Kв	Рис.3.15, 3.16

а	б	в
Рис.3.7. Определение основных кинетических параметров в случае однокомпонентного полностью конкурентного ингибирования фермента
а	б	в
Рис.3.8. Определение основных кинетических параметров в случае однокомпонентного полностью неконкурентного ингибирования фермента

Рис.3.9. Определение основных кинетических параметров в случае двухкомпонентного полностью конкурентного взаимозависимого ингибирования		Рис.3.10. Определение основных кинетических параметров в случае двухкомпонентного полностью неконкурентного взаимозависимого ингибирования
а б
Рис.3.11. Определение основных кинетических параметров в случае ингибирования фермента субстратом		Рис.3.12.Интегральные координаты для случая ингибирования фермента продуктом
а	б
Рис.3.13. Необратимая инактивация фермента в свободном виде	Рис.3.14. Необратимая инактивация фермента в составе фермент-субстратного комплекса

Рис. 3.15. Определение k₂, рКа^!, рК_в^! Рис. 3.16. Определение k₂, K_s, pK_a, pK_b