Лабор.діагност.вірус.хв

метиленової синьки (2 частини); промивають ФБР, висушують на повітрі.

Нервові клітини (цитоплазма, ядра та ядерця) зафарбовуються в синій колір, інтерстиціальна тканина рожева, еритроцити цегляночервоні, а тільця Бабеша-Негрі пурпурово-червоного кольору з темносиньою зернистістю.

МОЛЕКУЛЯРНА ГІБРИДИЗАЦІЯ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Перспективним методом у лабораторній діагностиці вірусних інфекцій є молекулярна гібридизація(МГ) нуклеїнових кислот, яку використовують із метою виявлення вірусних ДНК- і РНК-геномів безпосередньо в патологічному матеріалі. Цей метод незамінний для ідентифікації вірусів, що не культивуються в лабораторних умовах, а також персистувальних вірусів і провірусів(інтегровані вірусоспецифічні нуклеотидні послідовності в складі клітинних геномів).

1

Що таке гібридизація? Наприклад, молекулу двонитчастої ДНК денатурують на два окремі нуклеотидні ланцюги під дією температури +80...+100 °С або лугу, а потім у разі тривалої експозиції при +55...+65 °С одноланцюгові ДНК взаємодіють і утворюють двонит-часту молекулу, ідентичну вихідній. Такий процес називається гібридизацією. Реакція гібридизації може відбутися між будь-якими двома одноланцюговими нуклеїновими кислотами— ДЦК —ДНК, ДНК — РНК, РНК — РНК, але за обов'язкової умови: якщо вони мають комплементарні нуклеотидні послідовності.

Одноланцюгові ДНК і РНК, за допомогою яких у дослідному матеріалі виявляють комплементарні нитки, називають зондом. Для його одержання можна використовувати нуклеїнову кислоту, виділену з віріонів, або іРНК, отриману шляхом транскрипції іпУІІГО. Проте найдешевшим зондом є клонована рекомбінантна ДНК— ДНК-зонд. Його виготовляють на основі плазмідного вектора, в який вбудовують

висококонсервативний фрагмент			вірусної	ДНК або ДНК-копію
потрібного фрагмента вірусної РНК, що одержують шляхом зворотної
транскрипції.	Рекомбінантну	ДНК	мітять	відповідним методом
(радіоактивним	фосфором або	біотином) і денатурують при+80.
..+100 °С. У результаті отримують дві одноланцюгові молекули ДНК
із вірусоспецифічними нуклеотидними послідовностями, які є ДНК-
зондами.

Для мічення зонда використовують радіоактивні попередники, зазвичай радіоактивний фосфор(Р32). Реакцію мічення зонда називають нік-трансляцією. Вона основана на розривах нитки ДНК -єн

донуклеазою й одночасному ковалентному приєднанні до кінців

розривів за допомогою кінцевої	трансферази нуклеотидів, мічених
32	32
Р . Недоліком цього методу є	короткий період напіврозпаду Рі

необхідність мати спеціальне устаткування для виявлення радіоактивності. Тому перспективнішим є застосуванняколориметричних реакцій. Для цього в молекулу зонда під час нік-трансляції вводять біотин, який може міцно зв'язувати авідин або стрептовіридин, що у свою чергу з'єднані з ферментом(пероксидазою або лужною фосфатазою). Якщо додати до такого зонда відповідний субстрат, під дією ферменту субстрат розкладається, утворюючи кольоровий продукт реакції, видимий візуально.

Швидкість гібридизації залежить від багатьох умов, найважливішими з яких є температура реакції та йонна сила розчину. Температура, за якої половина молекул нуклеїнової кислоти перебуває у дволанцюговій формі, називається температурою плавлення. Реакція гібридизації має широкий температурний оптимум— від +30 до +65

°С, що	нижче за	температуру	плавлення. Реакція	відбувається
найкраще	при 0,4М	+	+	гібридизації
		Ка; при 0Д5М	Ш швидкість

знижується майже в 7 разів. На швидкість реакції впливають також в'язкість і рН розчину, кількість пар основ ДНК у дуплексі тощо. Від цих самих умов залежить утворення стабільних гібридів, отжеі , специфічність реакції.

Методика індикації вірусних нуклеїнових кислоту пато-

логічному матеріалі об'єднує такі етапи: 1)одержання і мічення зонда (Р32 або біотином);

2)виділення з патологічного матеріалу нуклеїнових кислот та їхня

денатурація (центрифугат суспензії з	дослідного матеріалу-	об
робляють спочатку протеїназою К, потім	фенолом із хлороформом,

які руйнують білки; після їхнього видалення нуклеїнові кислоти осаджують при -70 °С, осад відмивають спиртом і піддають денатурації кип'ятінням або обробкою лугом);

3)контакт одноланцюгових нуклеїнових кислот із зондом при +55...+65 °С упродовж близько 2 год, що призводить до утворення дволанцюгових молекул у разі їхньої комплементарності(молекулярна гібридизація);

4)видалення всіх негібридизованих молекул нуклеїнових кислот (обробкою натрію додецилсульфатом і натрію цитратом);

5)індикація утворених дволанцюгових молекул нуклеїнових кислот за міткою зонда (Р32 виявляють методом автор адіографії або підрахунком імпульсів у гамма-лічильнику, а наявність біотину

встановлюють колориметричним методом).
Існує кілька варіантів методу молекулярної гібріщизації.
Гібридизація на фільтрі. Найзручнішим і найпростішим методом є
гібридизація нуклеїнових кислот не в розчині, а іммобілізо на
твердому носії — нітроцелюлозному фільтрі. Для цього на фільтр
наносять дослідну нуклеїнову кислоту (в одноланцюговій формі),
додають мічений зонд. У разі комплементарності двох молекул
нуклеїнових кислот утворюються гібриди, прикріплені до носія, де і
проводять їхню ідентифікацію.
Точкова гібридизація дає змогу одночасно дослідити багато
проб, наносячи на нітроцелюлозні фільтри виділені з патологічного
матеріалу нуклеїнові кислоти, а потім мічений зонд.
Блот-гібридизація (або блотинг за Саузерном). Дослідну ДНК
нарізують	рестрикційними	ендонуклеазами		на	фрагменти, які
розділяють електрофорезом в агарозі або поліакриламідному . гелі
Потім фрагменти переносять на нітроцелюлозні фільтри і додають
мічений зонд. Метод застосовують для виявлення в пухлинній тканині
інтегрованих вірусних геномів і для визначення кількості про-вірусів
у клітинних ДНК. Аналогічний метод можна використовувати і для
виявлення фрагментів РНК.
Сандвіч-гібридизація ґрунтується на використанні двох клоно-
ваних фрагментів ДНК, один з яких іммобілізований на нітроцелю-
лозному фільтрі, а другий є міченим зондом. Наявна в дослідній пробі
комплементарна нитка нуклеїнової кислоти гібридизується з обома
нитками ДНК і зв'язує зонд із фільтром. Можливий інший варіант
методу: зонд гібридизується з відомою ДНК, іммобілізованою на
фільтрі, та зв'язує комплементарну ДНК, що знаходиться в пробі.
Гібридизацію іп віїи застосовують			при дослідженні		замороже-
них зрізів тканин із метою індикації вірусних нуклеїнових кислот в
окремих клітинах. Метод використовують для вивчення персисту-
вальних і онкогенних вірусів.
Молекулярна гібридизація є високочутливою реакцією, яка дає
змогу встановити в дослідному матеріалі нуклеїнові кислоти в- ни
зьких концентраціях (1 - 10 пг*). Проте чутливість методу часто не-
достатня для виявлення провірусів, якщо заражено небагато клітин в
організмі. У такому разі проводять ампліфікацію вірусних нуклеї-
нових кислот шляхом додавання РНК-затравки, комплементарної
певним ділянкам обох ниток ДНК у консервативній частині молекули,
і потім ідентифікують ДНК за допомогою міченого зонда.
Метод	молекулярної	гібридизації		нуклеїнових		кислот
застосовують	з діагностичною	метою	нечасто,	скільки	для нього

потрібні	спеціальні	реактиви	та	обладнання. Проте	розвиток
технології виробництва ре-комбінантних ДНК і хімічного синтезу
нуклеїнових	кислот	дає	змогу	одержувати	зонди	будь-якої
специфічності, що сприятиме широкому впровадженню цього методу
у вірусологічну практику.

ПОЛІМЕРАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ (ПЛР)

В основу ПЛР покладено блискучі досягнення молекулярної біології: відкриття ферменту ДНК-полімерази, розробка методу секве-нування молекули ДНК, а також синтез олігонуклеотидів різної довжини і специфічносте (праймерів). Суть ПЛР (або методу ампліфікації генів) полягає в збільшенні іпУІЬГО генетичного матеріалу вірусу, який треба ідентифікувати в дослідному матеріалі. При цьому ампліфікуються головним чином конкретні(здебільшого консервативні) фрагменти вірусного геному.

Ділянку ДНК, яку потрібно копіювати, називають ампліфіконом. Його межі визначаються, як правило, двома олігонуклеотидними праймерами. Це відрізки одноланцюгової ДНК завдовжки 20 — 30 нуклеотидів, які комплементарні певним послідовностям кожної з

ниток	ДНК-матриці та	слугують затравкою для синтезу нового
ланцюга ДНК. При синтезі ДНК праймери фізично вбудовуються у
фрагменти ДНК-матриці, що ампліфікується.
	Праймери добудовує до заданого розміру термостабільний фер-
мент	Тац-ДНК-полімераза,	яка одержана з термофільної бактерії

ТпегторЬуІие адиайсив. Тад-ДНК-полімераза витримує багаторазове нагрівання до +90 °С, що дало змогу проводити реакції в автоматичному режимі — ампліфікаторі. Тад-ДНК-полімераза синтезує ланцюг ДНК розміром до 1000 пар нуклеотидів за 1 хв. Можливості ПЛР

в ідентифікації вірусів ще більше зросли у зв'язку з виділенням із термофільної бактерії Тпегпшв іпегторпукш ферменту, що виявляє активність як ДНК-полімерази, так і зворотної транскриптази. За допомогою цього ферменту спрощується виявлення у ПЛР -РНК вмісних вірусів. Тад-ДНК-полімераза продовжує олігонуклеотидні праймери, додаючи до їхнього З'-кінця наступний додатковий нуклеотид. Але для цього потрібен праймер, гібридизований із комплементарним ланцюгом ДНК-матриці. її пошук і є завданням ПЛР.

Реакційна суміш, де відбувається ПЛР, має містити в достатній кількості нуклеотиди («будівельні блоки»), специфічні олігонуклеотидні праймери і дослідний матеріал у вигляді ізольованої з нього ДНК або ДНК-копії РНК-геному, яку отримують зворотною транскрипцією. ПЛР складається з трьох процесів, які

циклічно повторюються:

1)денатурація дослідної дволанцюгової ДНК нагріванням реакційної суміші до +90...+100 °С;

2)відпалювання праймерів (гібридизація праймерів із комплементарними ділянками одноланцюгової ДНК при +55...+65 °С);

3)елонгація (добудова) праймерів до заданого розміру вірусного геному під дією Тад-ДНК-полімерази при +72 °С.

Весь цикл ампліфікації триває всього 5 - 10 хв і може повторюватися до 20 - 40 разів. За кожний цикл відбувається подвоєння кі-

лькості	молекул		ДНК	у	. пробіКожен	із	новосинтезованих
ланцюгівДНК слугує матрицею для синтезу молекул ДНК, які за
довжиною й нуклеотидними послідовностями ідентичні ділянці ДНК,
вибраній для ампліфікації. Праймери орієнтовані так, щоб синтез за
допомогою		Та^-ДНК-полімерази			відбувався		тільки	між , ними
подвоюючи		кількість копій			заданої	ділянки . ДНКОптимальна
відстань між		праймерами (довжина ділянки				ампліфікації)		становить

200 -500 пар нуклеотидів. Практично вдається ампліфікувати фрагменти ДНК завдовжки до 3 - 4 тис. пар нуклеотидів, хоча можна досягти і 10 тис. пар нуклеотидів. За 40 циклів ампліфікації кількість копій ДНК зростає в1013 разів. Таку кількість вірусної ДНК тепер можна ідентифікувати будь-яким методом: електрофорез в агарозі або поліакриламідному гелі з фарбуванням бромистим етидієм, гібридизація з міченими зондами, безпосереднє колориметричне, флуорометричне чи радіоізотопне визначення при використанні в системі ПЛР мічених попередників синтезу нуклеїнових кислот.

Збільшення кількості вірусної ДНК у 106 разів цілком достатньо для виявлення її методом молекулярної гібридизації без попереднього нагромадження вірусу в культурі клітин. Слід зазначити, що довгі

необмежені копії ДНК можуть синтезуватися тільки з вихідних батьківських ланцюгів ДНК, і за 40 циклів ПЛР може утворитися тільки 40 таких копій кожного з батьківських ланцюгів, що дуже мало порівняно з кількістю основного продукту.

Нині ПЛР у поєднанні з методом молекулярної гібридизації успішно використовують для діагностики ВІЛ-інфекції, гепатиту В, папі-ломавірусних інфекцій людини, хвороби Ауєскі, чуми ВРХ, вірусної діареї ВРХ, інфекційного ринотрахеїту ВРХ, класичної та африканської чуми свиней, алеутської хвороби норок, хвороби Марека та ін. ПЛР незамінна при ідентифікації вірусів, для яких ще не знайдені чутливі культури клітин або не розроблені серологічні тести, а також при дослідженні проб із навколишнього середови, щоа сильно кон-таміновані мікроорганізмами і непридатні для зараження

культури клітин. Методом ПЛР можна не тільки ампліфікувати потрібну ДНК, а й вносити в неї при цьому необхідні зміни, що відкриває необмежені можливості для молекулярної біології та генної інженерії.

ВИДІЛЕННЯ ВІРУСІВ НА ЧУТЛИВИХ БІОЛОГІЧНИХ ОБ'ЄКТАХ

ВИДІЛЕННЯ ВІРУСІВ НА ЛАБОРАТОРНИХ ТВАРИНАХ

Однією з поширених моделей для виділення								вірусів	із
патологічного матеріалу є лабораторні тварини. Найчастіше у
вірусологічні її практиці використовують білих мишей, кролів, білих
щурів і морсі. ких свинок, рідше — золотистих хом'яків і тхорів. Іноді
як лаборатор1 ні об'єкти використовуються кури, голуби, кошенята,
щенята. І дуже рідко ставлять біопробу на природно сприйнятливих
тваринах (наприклад, при ящурі, інфекційній анемії коней, класичній
і африканській чумі свиней), що пов'язано з потенційною небезпекою
поширення інфекції та економічними витратами.
Основні вимоги, які ставляться до лабораторних тварин: 1) ма-
ють бути абсолютно здоровими; 2) мають бути чутливими до цього
вірусу (відповідного виду і віку); 3) повинні мати стандартну чутли-
вість до вірусу.
Тварин, які надходять до віварію вірусологічної лабораторії, ви-
тримують у карантині 2 — 3 тижні. У разі встановлення інфекційного
захворювання всю партію тварин знищують. Треба мати на увазі, що
в лабораторних тварин трапляютьсялатентні інфекції. Наприклад,
серед мишей може персистувати вірус ектромелії, який спричинює
некротичне запалення лап, а при генералізації інфекції— осередки
некрозу в печінці й селезінці. Пневмонії в мишей спричинюють
близько 10 вірусів, найчастіше вірус Сендай. Віруси лімфоцитарного
хоріоменінгіту			й	енцефаломієліту			мишей	спричинюють
нейроінфекції, які виявляються судомами, парезами і паралічами.
Серед	мишей		можуть	персистувати		онкогенні віруси		поліо, -ми
лейкозу,	пухлини		молочних залоз. У щурів				часто виділяється
латентний вірус Кілхема, який спричинює в хом'яків летальну - ін
фекцію з масовими крововиливами в кишках. У щурів також вияв-
ляють цитомегаловірус, який спричинює аборти.
Постановка біопроби на тваринах-вірусоносіях може призвести
до активізації			латентного		збудника	і діагностичної		помилки	в
кінцевому		результаті. Наявність безсимптомної					вірусної	інфекції
може проявлятися зниженням (аж до повного зникнення) чутливості
тварин	до	дослідного		вірусу	внаслідок	явища	інтерференції. Цих

труднощів удається уникнути, якщо періодично проводити контроль. Для виявлення латентних інфекцій убивають кількох тварин, із певних органів виготовляють суспензії та заражають відповідними методами тварин цієї самої групи(наприклад, суспензію з мозку

вводять	інтрацереб-рально).				За	наявності	безсимптомного
вірусоносійства зараження призводить до загострення інфекційного
процесу.	Крім	того,	для	виявлення		латентної	інфекції	тварин
обробляють відповідними препаратами, зокрема кортизоном, який
пригнічує імунну систему. Ступінь чутливості тварин до								вірусів
можна	встановити,		якщо		заражати	їх	заздалегідь	відомим
вірусовмісним матеріалом.
Для культивування вірусів використовують лабораторних тва-
рин того виду, який є чутливим до цього збудника. Наприклад, віруси
грипу людини і свиней добре репродукуються							в організмі	тхорів,
хом'яків та щурів,		а кролі й морські свинки несприйнятливі до них.

Вік тварини також має істотне значення при постановці біопроби. Більшість вірусів краще розмножується в організмі молодих і навіть новонароджених тварин. Так, до вірусу ящуру чутливі новонароджені

мишенята	і	кроленята, тоді			як	дорослі		тварини		абсолютно
резистентні. Біопроба при діагностиці сказу, інфекційної катаральної
гарячки	овець,	ринопневмонії			коней,	африканської			чуми	коней,
кліщового	енцефаліту			ставиться		на		мишенятах-сису. Онах-
когенність деяких вірусів (наприклад, аденовірусу ВРХ) вивчають на
новонароджених золотистих хом'ячках. При діагностиці вірусних
хвороб птиці (грипу,			віспи, ньюкаслської				хвороби,		інфекційного
бронхіту,	інфекційного		ларинготрахеїту,			хвороби		Марека) ставлять
біопробу	на курчатах. Разом з тим, в окремих випадках для
відтворення специфічних				клінічних ознак			хвороби		використовують

дорослих тварин, наприклад, кролів при діагностиці хвороби Ауєскі або морських свинок при діагностиці ящуру.

Стандартна чутливість до вірусу досягається добором тварин за принципом аналогів (одного віку, статі, маси). Однією пробою дослідного матеріалу заражають не менше чотирьох тварин. У науководослідній роботі використовують тваринінбредних ліній, одержані внаслідок близькородинного спаровування (впродовж не менш як20 поколінь), які практично однаково реагують на той чи інший вірус.

Для	деяких		вірусологічних		дослідже(наприкладь, при
виділенні	вірусу	з	нез'ясованими		патогенними		властивостями)
потрібно	застосовувати гнотобіотів.			Термін		«гнотобіоти» об'єднує
дві категорії тварин: 1) стерильні (безмікробні) тварини, які не мають
жодних мікробів; 2)		гнотофори, що		містять		один або	кілька видів

мікроорганізмів, відомих досліднику. Тварин-гнотобіотів одержують
шляхом кесарева розтину або ампутації матки, стерильну птицю —
інкубацією яєць зі стерильною шкаралупою в стерильному інкубаторі.
Тварин утримують у		стерильних ізоляторах: повітря,			вода, корми
мають бути стерильними. Нині одержані гнотобіоти в мишей, щурів,
кролів, морських свинок, свиней, овець, кіз, мавп, собак, котів, курей.
Гнотобіоти	чутливіші	до	вірусної	інфекц. Крімї	того, їхнє

застосування	повністю виключає вплив			латентних збудників, які
можуть персистувати в організмі лабораторних тварин. На жаль,
одержання	і	вирощування	гнотобіотів		пов'язано	з	великими
економічними витратами, що стримує їхнє				впровадження		в широку
вірусологічну практику.

Існують різні способи введення інфекційного матеріалу лабораторним тваринам, що визначається тропізмом вірусу. У вірусологічній практиці найчастіше використовують такі методи зараження: підшкірний, внутрішньошкірний, у скарифіковану шкіру, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, інтраназальний, інтрацеребральний. Рідко застосовують інші методи: субокципітальний (підпотиличний), іитраспінальний (у спинний мозок), у периферійний нервовий стовбур (сідничного або плечового нервів), інтракардіальний, інтратестикулярний, в око (на рогівку, в рогівку, в передню камеру), в кон'юнктиву, через травний канал (орально, в шлунок, ректально). Нижче описано найпоширеніші методи зараження лабораторних тварин.

Підшкірне зараження,. Місце ін'єкції — в ділянці спини, черева або бокової поверхні. Після видалення шерсті й дезінфекції спиртовим розчином йоду захоплюють складку шкіри, і в її основу паралельно до поверхні тіла вводять голку. Максимальна доза для

зараження: миші •— 0,5 см3, щури і морські свинки — 3, кролі — 5 см3.

Внутрішньошкірне зараження. У кролів і морських свинок на боці, череві або спині вистригають і виголюють шерсть, дезінфікують. Тонку голку скосом назовні вводять паралельно до поверхні шкіри так, щоб голка просвічувалася крізь епідерміс. Матеріал вводять до припіднімання шару шкіри у вигляді бугорка. Дрібним тваринам внутрішньошкірне зараження проводять у плантарну поверхню задньої кінцівки, вводячи голку в шкіру в напрямку від пальців до заплеснового суглоба. Максимальна доза для зараження: миші _ о,02 см3, щури — 0,05, морські свинки і кролі — ОД см3.

Зараження в скарифіковану шкіру. У ділянці боку, черева або спини вистригають і виголюють шерсть, дезінфікують. Роблять кі-

лька поверхневих подряпин голкою або пастерівською піпеткою(до появи крапель лімфи), наносять матеріал, який втирають шпателем або скляною паличкою.

Внутрішньом'язове зараження. Після видалення шерсті й дез-

інфекції голку вводять у м'язи стегна, спрямовуючи її перпендикулярно до поверхні тіла. Максимальні дози для зараження: миші — 0,3 см3, щури — 1, морські свинки — 2, кролі — 5 см3.

Внутрішньочеревинне (інтраперитонеальне) зараження. Тва-

рину фіксують вертикально вниз головою для того, щоб органи черевної порожнини змістилися до діафрагми і не травмувати кишки при інокуляції матеріалу. Відтягують задню кінцівку, дезінфікують ділянку паху, куди вводять голку під кутом45° до поздовжньої осі тіла на глибину 0,3 - 0,5 см. Максимальна доза для зараження: миші

— 1 см3, щури — 2, морські свинки — 5, кролі —-10. Внутрішньовенне зараження. Кролів заражають у крайову вену

вуха. На місці ін'єкції вистригають шерсть, дезінфікують шкіру, вухо

масажують або натирають ксилолом	і перетискають біля основи для
набухання вени. Голку вводять у	судину в напрямку до голови

приблизно на 1 см, при цьому перестають перетискати вухо. Білих мишей і щурів заражають у бокові вени хвоста, для розширення яких хвіст розтирають ксилолом або витримують у теплій воді(+50...+55 °С). Хвіст перетискають біля основи, вводять голку скосом назовні у вену нижньої третини хвоста, де шкіра тонша, в напрямку до тулуба.

Якщо голка потрапила в судину, то рідина				легко надходить зі
шприца, а судина на всьому проміжку біліє. Для внутрішньовенного
зараження	морської	свинки	потрібне	хірургічне	препарування
яремної вени. Максимальна доза для зараження: миші — 1 см3, щури
і морські свинки — 2, кролі — 5 см3.
Інтраназальне зараження.			Проводять	під легким	ефірним
наркозом (за винятком кролів), щоб уникнути розбризкування
вірусовмісної	суспензії	при	чханні. Сонну	тварину	фіксують

ніздрями догори і в кожну з них вводять інфекційний матеріал за допомогою шприца або пастерівської піпетки. Максимальна доза для зараження: миші — 0,05 см3, щури — 0,1, морські свинки — 0,3, кролі — 1 см3.

Інтрацеребральне зараження. У молодих кролів і морських свинок після видалення шерсті й дезінфекції проколюють шкіру і череп у надочному жолобі, де кістка досить.тонка. Для цього використовують туберкулінову голку з обмежувачем, що забезпечує її проникнення не більше ніж на4 — 5 мм. Кролів старшого віку заражають через трепанаційний отвір, який роблять на2 см вище поперекової лінії,

умовно проведеної між зіницями. У мишей і щурів голкою з обмежувачем проколюють шкіру і череп на глибину 1 — 2 мм у точці, що лежить у центрі квадрата, утвореного середньою сагітальною

лінією й перпендикуляром до неї по зовнішньому краю .очниць Максимальна доза для зараження: миші — 0,03 см3, щури — 0,05, морські свинки — 0,1, кролі — 0,3 см3.

Індикація вірусів у організжі лабораторних тварин. Зара-

жених тварин розміщують в ізоляторах і ведуть щоденне спостереження. Ознаками розмноження вірусіву організмі лабораторних тварин є клінічні симптоми, патологоанатомічні зміни і загибель (табл. 3). Треба мати на увазі, що загибель тварин у перші дні після зараження може бути зумовлена травмою або токсичними факторами. Клінічні ознаки в заражених лабораторних тварин найчастіше мають неспецифічний характер (наприклад, пригнічення, зниження апетиту, задуха та ін.). Однак в окремих випадках біопробою на лабораторних тваринах можна відтворити типову клінічну картину захворювання, зокрема хвороби Ауєскі на кролях і ящуру на морських свинках. Якщо тварини не реагують на зараження, їх убивають через проміжок часу, що дорівнює двом інкубаційним періодам, беруть при розтині відповідний матеріал і проводять наступний пасаж.

Розтин заражених лабораторних тварин роблять відразу після загибелі з метою аналізу патологоанатомічних змін і відбору вірусовмісного матеріалу. Трупи дрібних тварин фіксують голками па дошці або кюветі з парафіном у спинному положенні. Для великих тварин

використовують спеціальні столики або дошки з відповідними фіксувальними пристосуваннями.

Розтин проводять із дотриманням правил асептики й антисептики. Основне правило розтину: до трупа можна торкатися ТІЛЬКИ пі

струментами або руками в гумових рукавицях. Перед ро.гп шкіру обробляють спиртом або дезрозчином (3-5%-іі фенол). Для препарування шкіри і підшкірної клітковини роблять роарі.і і редній лінії від симфізу до шиї, а далі — в напрямку до кінн ий,, шкіру препарують і фіксують голками