3 Надф`

-СО₂ НАДФ·Н₂

Рибулозо-5-фосфат

4

Рибозо-5-фосфат

5

Глицеральдегид-3-фосфат Ацетилфосфат

НАД` АДФ

+Фн НАД·Н₂ АТФ -Фн НАДФ·Н₂

1,3-Дифосфоглицерат НАДФ`

2Адф Ацетат Ацетальдегид

2Атф надф·н2

Пируват НАДФ`

НАД·Н₂ Этанол

НАД`

Лактат

Рис. 13.2. Схема расщепления глюкозы гетероферментативными молочнокислыми бактериями по пентозофосфатному пути

Примечание. Цифры на схеме обозначают ферменты, катализирующие реакции: 1 – гексокиназа, 2-глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа; 3-6-фосфоглюконат-декарбоксилаза; 4-изомераза; 5-фосфокетолаза.

В ходе реакций по пентозофосфатному пути из каждого моля глюкозы образуется моль молочной кислоты, моль этанола и углекислого газа:

С₆Н₁₂О₆ + Фн + АДФ → С₃Н₆О₃ + С₂Н₅ОН + СО₂ + АТФ

Фруктозо-6-фосфатный путь расщепления глюкозы бифидобактериями. Бифидобактерии (В_. /bifidum, B.longum, B.adolescentis и др.) в отличие от пентозофосфатного пути превращают глюкозу не в глюкозо-6-фосфат, а во фруктозо-6-фосфат, который далее расщепляется фосфокетолазой на эритрозо-4-фосфат и ацетилфосфат (рис. 13.3). Затем эритрозо-4-фосфат и фруктозо-6-фосфат под действием ферментных систем превращаются в два моля пентозо-5-фосфата, который расщепляется на ацетилфосфат и глицеральдегид-3-фосфат. Далее глицеральдегид-3-фосфат образует два моля пирувата, которые восстанавливаются в лактат.

Глюкоза

2АТФ

2АДФ

Фруктозо-6-фосфат Фруктозо-6-фосфат

Структурная Фн

перестройка Эритрозо-4-фосфат

сахара Ацетилфосфат

АДФ

2 Пентозо-5-фосфат атф

2Фн Ацетат

2 Глицеральдегид-3-фосфат 2Ацетилфосфат

4АДФ 2НАД` АДФ

4АТФ 2НАД·Н₂ АТФ

2Пируват 2Ацетат

2 Лактат

Рис. 13.3. Путь сбраживания глюкозы бифидобактериями

А два моля ацетилфосфата дефосфорилируются и образуют два моля ацетата. Таким образом, в результате сбраживания продуктов гидролиза лактозы бифидобактериями происходит образование уксусной и молочной кислот в молярном отношении 3:2.

Бифидобактерии имеют низкую β-галактазидазную активность и плохо развиваются в молоке. Для стимуляции их роста в закваски вводят культуры термофильного стрептококка, обладающего повышенной β-галактозидазной активностью.

Спиртовое брожение. Спиртовое брожение имеет место при выработке кефира, кумыса, курунги и других кисломолочных продуктов. Возбудителями спиртового брожения являются дрожжи родов Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Fabospora, Torulopsis и др. Они сбраживают глюкозу с образованием этанола и диоксида углерода:

С₆Н₁₂О₆ + Фн + 2АДФ → 2С₂Н₅ОН + 2СО₂ + 2АТФ

Превращение глюкозы в пировиноградную кислоту в первой стадии спиртового брожения идет по гликолитическому пути аналогично гомоферментативному молочнокислому брожению (см.рис.13.1). Затем пировиноградная кислота подвергается декарбоксилированию с образованием уксусного альдегида и углекислого газа при участии фермента пируватдекарбоксилазы. Уксусный альдегид при участии НАД·Н₂ восстанавливается в этанол:

СН₃СОСООН → СО₂ + СН₃СНО,

СН₃СНО + НАД·Н₂ → С₂Н₅ОН + НАД `

Кроме этанола и углекислоты дрожжи могут образовывать в небольшом количестве другие спирты (изобутиловый, пропиловый, глицерин), уксусную, пропионовую и янтарную кислоты, а также ацетоин и диацетил.

Пропионовокислое брожение. Возбудителем брожения являются пропионовокислые бактерии (Propionibacterium), которые превращают глюкозу или молочную кислоту в пропионовую и уксусную кислоты. Одновременно образуется небольшое количество янтарной кислоты. Если брожение начинается с глюкозы, то процесс образования пировиноградной кислоты идет аналогично гомоферментативному молчонокислому брожению. Если же брожению подвергается молочная кислота, то путем дегидрирования (при участии лактатдегидрогеназы) она также превращается в пировиноградную кислоту. В дальнейшем одна часть пировиноградной кислоты подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием ацетил-КоА, который через ацетилфсфат переходит в уксусную кислоту (в реакциях участвуют ферменты пируватдегидрогеназа, фосфо-трансацетилаза и ацетаткиназа):

+HS – KoA; НАД` О +Фн

СН₃СОСООН СН₃ - С

-СО₂ S-КоА – НS-КоА

О +Н₂О

СН₃ – С СН₃СООН

Ф АДФ АТФ

Другая часть пировиноградной кислоты превращается в пропионовую через промежуточные стадии образования щавелевоуксусной, яблочной и янтарной кислот.

Суммарное уравнение пропионовокислого брожения глюкозы (если одна треть молекул глюкозы превращается в уксусную кислоту, а две трети – в пропионовую) имеет следующий вид:

3С₆Н₁₂О₆+8Ф_Н+8АДФ→4СН₃СН₂СООН+2СН₃СООН+2СО₂+2Н₂О+8АТФ

Пропионовокислое брожение играет важную роль в процессе созревания твердых сычужных сыров с высокой температурой второго нагревания. Продукты этого брожения обусловливают специфический вкус и аромат сыров, а также участвуют в формировании их рисунка.

Маслянокислое брожение. Инициатором брожения являются маслянокислые бактерии (Cl.buturicum и др), сбраживающие как глюкозу, так и молочную кислоту.

До образования пировиноградной кислоты брожение идет по гликолитическому пути. Затем пировиноградная кислота декарбоксилируется до ацетил-КоА. Одна часть молекул ацетил-КоА переходит в ацетилфосфат и далее в уксусную кислоту. Другая часть ацетил-КоА конденсируется в ацетоацетил-КоА, который через ряд реакций превращается в масляную кислоту.

По характеру образования конечных продуктов различают несколько типов маслянокислого брожения. Так, конечными продуктами одного из типов брожения являются масляная и уксусная кислоты, углекислота и водород:

2С₆Н₁₂О₆+2Н₂О+7Ф_Н+7АДФ→СН₃(СН₂)₂СООН+2СН₃СООН+4СО₂+6Н₂+7АТФ

При другом типе маслянокислого брожения происходит образование бутилового и изопропилового спиртов или этанола и ацетона.

Таким образом, в процессе маслянокислого брожения наряду с масляной кислотой образуется ряд побочных веществ, часто обладающих резким, неприятным запахом, а также большое количество газов.

Маслянокислое брожение – нежелательный процесс в производстве кисломолочных продуктов и особенно сыров. Продукты жизнедеятельности маслянокислых бактерий являются причиной появления в кисломолочных продуктах неприятного вкуса и запаха или вспучивания сыров.

Уксуснокислое брожение. В молочных продуктах может проходить уксуснокислое брожение под действием уксуснокислых бактерий, являющихся часто спутниками дрожжей, либо появляющихся на поверхности продуктов. При использовании кефирных грибков, происходит неполное окисление части образовавшегося этанола до уксусной кислоты:

Чистые культуры уксуснокислых бактерий плохо развиваются в молоке, так как не усваивают лактозу, а источниками углерода для них служат этанол и лактат. Однако, их рост усиливается при совместном культивировании с дрожжами (и молочнокислыми бактериями). В кефире, приготовленном на чистых культурах, уксуснокислые бактерии постепенно вытесняют дрожжи и накопление спирта прекращается. В кефире, выработанном на кефирных грибках, дрожжи не исчезают полностью. Вероятно, они находятся в метабиозе: дрожжи, образуя этанол, создают условия для развития уксуснокислых бактерий. Однако, при излишнем развитии уксуснокислых бактерий происходит ослизнение кефирных грибков и образование тягучей консистенции закваски.

13.2.2. Роль продуктов брожения в формировании вкуса,

аромата и консистенции молочных продуктов

Характерные вкус и аромат молочных продуктов – кисломолочных напитков, сметаны, кислосливочного масла, сыров во многом определяется накоплением большого количества соединений в процессах брожения молочного сахара. К ним относятся карбонильные соединения – альдегиды (ацетальдегид, пропионовый альдегид и др.) и кетоны (ацетон, ацетоин, диацетил и др.); карбоновые кислоты (молочная, уксусная, пропионовая, лимонная, муравьиная, масляная и др.); спирты и их эфиры (этанол, пропанол и др.); диоксид углерода и ряд других соединений.

Кроме этого, образующиеся при брожении соединения участвуют в формировании структуры и консистенции молочных продуктов: они определяют характер получаемых белковых сгустков, их структурно-механические и синеретические свойства, а в сырах – дополнительно и характер формирования рисунка.

Каждое из соединений, определяющих органолептические характеристики продуктов, имеет специфический вкус и аромат, а степень участия в формировании этого показателя зависит от их концентрации и соотношений. Некоторые соединения, несмотря на их высокую концентрацию, оказывают незначительное влияние на формирование вкуса и аромата, так как обладают высокой пороговой чувствительностью. И напротив, соединения, имеющие очень низкие величины порога чувствительности, существенно влияют на вкус и запах продукта, присутствуя в незначительных концентрациях.

Ацетальдегид. Образуется в процессе жизнедеятельности различных микроорганизмов: молочнокислых, пропионовокислых, уксуснокислых, дрожжей. Главными источниками образования ацетальдегида в заквасках и продуктах являются пирувит, ацетилфосфат и цитрат.

Молочнокислые палочки Lbm.bulgaricum для образования ацетальдегида используют аминокислоту треонин.

При хранении заквасок и кисломолочных продуктов содержание ацетальдегида снижается, так как часть его превращается в этанол, либо используется на образование диацетила и ацетоина цитратсбраживающими ароматобразующими молочнокислыми стрептококками (Lac.diacetilactis, Leu.cremoris и Leu.dextranicum). При высоких концентрациях ацетальдегида продукт приобретает резкий привкус.

Диацетил и ацетоин. Как отмечено выше, эти соединения являются продуктами метаболизма ароматообразующих молочнокислых бактерий. Кроме того, их могут продуцировать (в меньшей степени) другие молочнокислые бактерии (Str.thermophilus, Lbm.casei, Lbm.plantarum, Lbm.brevis), а также дрожжи и пропионовокислые бактерии.

Предшественником диацетила и ацетоина является пируват, который ароматообразующие стрептококки образуют в основном из цитрата. Поэтому для усиления аромата кисломолочных продуктов за счет накопления диацетила при их производстве в молоко или сливки (в производстве кислосливочного масла) вносят цитрат.

При сбраживании глюкозы лейконостоками и дрожжами в качестве побочных продуктов могут также образовываться в небольших количествах диацетил и ацетоин.

Накопление вкусовых и ароматических веществ в кисломолочных продуктах регулируют составом заквасок, использованием многоштаммовых заквасок, уровнем рН и температурными режимами.

В процессе молочнокислого брожения образуется молочная кислота, которая имеет существенное значение для формирования структуры и консистенции кисломолочных продуктов, кислотно-сычужных и кисломолочных сыров. В производстве молочных продуктов этих групп применяют кислотное или кислотно-сычужное свертывание (в производстве кислотно-сычужных сыров и творога кислотно-сычужным способом).

Кислотное свертывание (коагуляция) заключается в постепенном снижении величины рН молока или сливок (в производстве сметаны) под действием образующейся в процессе молочнокислого брожения молочной кислоты. При медленном росте кислотности происходит снижение отрицательного заряда на поверхности мицелл и уменьшение сил электростатического отталкивания; переход коллоидного фосфата в растворимую форму; потеря гидратной воды, структурные изменения, в результате чего мицеллы теряют устойчивость и молоко или сливки свертываются. Механизм кислотной коагуляции подробно обсуждался при изучении темы 10 (п.п. 10.2.1; 10.2.2). Трехмерная пространственная структура, охватывающая весь объем сквашиваемого молока, образуется только тогда, когда силы притяжения мицелл медленно преодолевают силы электростатического отталкивания.

Кислотно-сычужное свертывание характеризуется потерей устойчивости мицелл казеина, но при одновременном воздействии молочной кислоты и сычужного фермента. Механизм сычужной коагуляции обсуждался при изучении темы 10 (п.п. 10.2.1; 10.2.2).

Оба способа коагуляции приводят к формированию из реконструированных мицелл, соединенных в пряди, с помощью поперечных связей трехмерной сетчатой структуры, удерживающей в своих ячейках сыворотку. Кислотные сгустки отличаются от кислотно-сычужных и сычужных (в производстве сычужных сыров или сычужного казеина) отсутствием связей через коллоидный фосфат кальция.

Характер формируемых сгустков, их структурно-механические и синеретические свойства влияют на формирование структуры и консистенции вырабатываемых продуктов.

13.2.3. Протеолиз и формирование органолептических

показателей

Протеолиз – ферментативное гидролитическое расщепление белков имеет место при длительном хранении сырого молока, в производстве различных кисломолочных продуктов. Протеолитическое расщепление казеинаткальцийфосфатного комплекса является первой стадией сычужного свертывания в производстве сыров, творога кислотно-сычужным способом, казеина сычужного. Особое значение имеет протеолиз в созревании сыров как основополагающий процесс формирования их специфических органолептических характеристик.

Интенсивность протеолиза обусловлена многими факторами: протеолитической активностью заквасочных микроорганизмов, уровнем рН, температурными режимами, влажностью продукта и др. Продуктами гидролиза белков являются пептиды с различной молекулярной массой и аминокислоты. Под действием различных ферментных систем аминокислоты могут подвергаться изменениям с образованием органических кислот, альдегидов, аминов и других соединений, многие из которых обладают выраженными вкусовыми свойствами и вместе с продуктами биохимических превращений лактозы участвуют в формировании органолептических свойств продуктов. Направленность ферментативного гидролиза белков в производстве молочных продуктов регулируют путем подбора в состав заквасок различных видов микроорганизмов по их протеолитической активности.

Нерегулируемый протеолиз под действием протеаз посторонних микроорганизмов, в том числе и гнилостных в сыром молоке или термоустойчивых нативных и бактериальных протеаз остаточной микрофлоры, может явиться причиной образования различных соединений с неприятным запахом и вкусом, которые обусловливают порчу продукта.

В производстве сыров и творога гидролиз белков обусловлен также действием внесенных ферментных препаратов – химозина (сычужного фермента) и пепсина, которые обладают свертывающей активностью. Под действием внесенного в молоко сычужного фермента происходит ферментативный гидролиз полипептидных цепей κ-казеина ККФК. Механизм гидролитического действия сычужного фермента заключается в расщеплении пептидной связи, образованной фенилаланином (остаток 105) и метионином (остаток 106) в цепи κ-казеина (см.тему 10, п.10.2.2). В результате отщепления гликомакропептида под действием сычужного фермента казеиновые частицы теряют заряд, а следовательно и устойчивость и переходят в параказеиновые, которые за счет сил молекулярного притяжения и при участии ионов кальция образуют агрегаты и затем пространственную сетку сгустка.

Таким образом, при сычужном свертывании происходят биохимические изменения казеина и затем физико-химические процессы коагуляции и структурообразования.

После свертывания молока в производстве сычужных сыров молокосвертывающие ферменты наряду с бактериальными и нативными протеазами участвуют в процессах распада белков сырной массы при созревании с образованием многочисленных азотистых соединений. Степень участия молокосвертывающих ферментов в созревании сыров зависит от их свойств и количества в сырной массе.

При созревании сыра сычужный фермент в большей степени атакует α_S-казеин и медленно или почти не атакует β-казеин, так как α_S-казеин содержит большое количество чувствительных к химозину пептидных связей. В резульатте действия сычужного фермента происходит неглубокий распад казеина с образованием высокомолекулярных полипептидов и пептидов, которые затем гидролизуются под действием как внеклеточных (экзоферментов), так и внутриклеточных (эндоферментов) протеаз бактерий. Бактериальные ферменты кроме этого могут гидролизовать и сами фракции казеина, поэтому им отводится ведущая роль в ферментативном гидролизе белков сырной массы.

В процессе созревания сыров степень и глубина протеолиза, а следовательно, накопление его продуктов (растворимых в воде пептидов, свободных аминокислот) зависит от протеолитической активности бактериальных и молокосвертывающих ферментов, технологических параметров и режимов выработки сыров, содержания в них влаги, уровня активной кислотности, концентрации соли и др. Так, например, гидролитическому расщеплению в производстве рассольных сыров подвергается около 8% белков; сыров с низкой температурой второго нагревания – от 20 до 25%; с высокой температурой второго нагревания – от 25 до 30% и мягких сыров – около 40%.

Продукты гидролиза белков (пептиды, свободные аминокислоты) оказывают влияние на формирование вкуса и запаха молочных продуктов, так как обладают определенными вкусовыми характеристиками. Например, глицин, аланин, серин, пролин имеют сладкий вкус; аргинин, гистидин, лейцин и триптофан – горький; валин, треонин, фенилаланин – сладко-горький; глутаминовая и аспарагиновая кислоты – кислый; цистин и метионин – сернистый.

При производстве молочных продуктов и особенно при созревании сыров свободные аминокислоты подвергаются воздействию различных ферментных систем, результатом которого являются реакции их дезаминирования, переаминирования, декарбоксилирования и др. Процесс дезаминирования аминокислот в зависимости от условий среды может идти окислительным путем с образованием кетокислот; гидролитическим – с образованием оксикислот и восстановительным – с образованием карбоновых кислот (пировиноградной, пропионовой, янтарной, изомасляной, яблочной и др.).

В свою очередь продукты дезаминирования свободных аминокислот могут подвергаться декарбоксилированию при участии декарбоксилазы с образованием альдегидов.

Декарбоксилированию подвергаются и свободные аминокислоты, особенно при созревании сыров, в результате которого образуются амины и диоксид углерода (углекислый газ). Амины обладают ярковыраженными вкусовыми свойствами и в зависимости от концентрации могут участвовать в формировании вкусовой композиции продукта, либо обусловливать пороки вкуса и запаха (аммиачный, рыбный и др.).

Таким образом, при гидролитическом расщеплении белков и последующих реакциях биотрансформации продуктов гидролиза происходит накопление большого количества различных соединений, которые участвуют в формировании органолептических свойств молочных продуктов.