Рекомендации к составлению протокола

Отметить результаты реакций на белок с содержимым диализа­ционного мешочка и наружной жидкостью, а также реакций на хлориды в наружной жидкости до начала диализа и после него. В выводах указать, почему белки не диффундируют через поры полу­проницаемой мембраны.

3.3. Хроматография аминокислот на бумаге

Анализ аминокислот в гидролизатах белков, в сыворотке крови необходим для оценки функции пораженной печени и для доказательства заболеваний, возникающих из-за нарушения обмена аминокислот.

Используют различные си­стемы растворителей, например фенол, насыщенный водой. Вода с примесью фенола адсорбируется на бумагу и образует неподвижную фазу. Фенол, насыщенный водой, служит подвижной фазой. Хроматографию для ускорения проводят при 40 °С. Аминокислоты на хроматограммах выявляют реакцией с нингидрином. Образуются пурпурные и фиолетовые пятна.

Реактивы и материалы: Раствор лейцина, аланина и глутаминовой аминокислоты, 0,04 М, фенол, насыщенный водой, нингидрин, 0,1% раствор в ацетоне.

Оборудование и посуда: термостат, сушильный шкаф, имеющий перекладины с крючками для подвешивания хроматограмм, большие пробирки 2,4x18 см с плотными пробками, штативы для больших пробирок, полосы хроматографической бумаги «быстрая» 1,5x15 см, иглы с нитками, простые карандаши и линейки с делениями, калиброванные пастеровские микропипетки, чашки петри или пульверизаторы, пипетки на 5 мл, пинцеты.

Порядок выполнения работы

Стараться не касаться полосок бумаги руками, чтобы при обра­ботке нингидрином не образовались побочные пятна.

1. Один конец полоски прокалывают иглой с ниткой. Нитку за­вязывают, чтобы получилась петля 5—6 см длиной.

2. На расстоянии 2 см от другого конца полоски проводят ка­рандашом линию старта. В центре ее делают кружок диаметром 3 мм для нанесения в это место раствора аминокислот.

3. Укладывают полоску на стеклянные пробирки и наносят 0,02 мл раствора аминокислот последовательно порциями, подсушивая пят­но, чтобы оно не выходило за пределы кружка.

4. В сухую пробирку для хроматографии на дно пипеткой нали­вают 2 мл фенола, насыщенного водой, стараясь не смочить стенки пробирки. Ставят пробирку в штатив строго вертикально.

5. Полоску опускают в пробирку, погружают на 0,5 см в фенол, стараясь ни в коем случае не размыть нанесенные аминокислоты. Пробирку плотно закрывают пробкой, прижимая петлю, чтобы по­лоска висела на нужном уровне (см. рис.).

6. Ставят штатив с пробирками в термостат, на­гретый до 40 °С на 1,5 часа.

7. После хроматографии полоску вынимают, под­вешивают за петлю в сушильном шкафу и высуши­вают 10 минут при 100 °С.

8. В чашку Петри наливают 15—20 мл раствора нингидрина. Полоску, удерживая пинцетами, про­водят через раствор и вновь помещают в сушильный шкаф на 5—7 минут при 100 °С.

На хроматограмме измеряют линейкой расстоя­ния от старта до середины пятен аминокислот и до фронта растворителя. Вычисляют коэффициент распре­деления для каждой аминокислоты.