Приготовление и исследование образцов

В биохимических исследованиях используются расти­тельные и животные ткани, а также продукты жизнедея­тельности животных. В растениях анализу подвергаются семена, корни, корневища, корнеплоды, стебли, листья, цветки. У животных исследуют биохимические показатели в биологических жидкостях (моча, кровь, спинномозго­вая жидкость, молоко), а также в тканях органов (печень, селезенка, желудок, сердце, мозг и т. д.) и мышечную, костную, нервную, жировую ткани, эндокринные железы.

Перед началом анализа исследуемый образец взве­шивают на аналитических весах, а затем ткань измель­чают. Все операции произ­водят при низкой темпера­туре, с охлаждением инст­рументов, используемых во время опытов, а Реактивы и материалы должны быть помещены в ледяную баню. Если разру­шение растительных тка­ней проводили на механи­ческой мельнице, то перед экстракцией по­мол необходимо взвесить, так как часть образца тка­ни во время измельчения может быть потеряна.

Для измельчения животных и растительных тканей с низкой влажностью (5–15%) используются механиче­ские мельницы. Разрушение тканей с высокой влажно­стью (65-–90%) проводят на гомогенизаторах. Ткани со средней влажностью (15–65%) обычно предварительно высушивают в сушильных шкафах с вакуумом при низ­кой температуре (60–70°С), что обеспечивает максималь­ную сохранность в них функционально активных веществ.

Перед началом экстракции ФАВ из разрушенных тка­ней животных и растений необходимо правильно подо­брать растворитель. Экстракцию полярных, заряженных соединений проводят используя полярные растворители (вода, 50%-ный раствор этанола). Экстракцию гидрофоб­ных компонентов гомогената тканей проводят с исполь­зованием неполярных растворителей (гексан, хлороформ, диэтиловый эфир и др.) или водных растворов с детергентами (тритоны: Х-45, Х-100, Х-114, Х-102, Х-165, Х-305; бридж: 35, 56, 58; луброл РХ и WX; твин: 20, 40, 60, 80 и др.).

Реагент	Время экстракции, час
	1	2
Этанол 50%-ный	340 (100)	400 (100)
Хлороформ	146 (43)	118 (29)
Диэтиловый эфир	26(8)	60 (15)
Ацетон	77 (23)	70 (17)

Использование 50%-ного этанола обеспечивает максимальную экстракцию полярных БАВ из растительных тканей.

Влияние среды экстрагирования на содержание антиоксидантов (мкг/г сухих растений) в экстракте. Отделение неразрушенных клеток и ядер проводят центрифугированием. Режим центрифугирования подби­рается индивидуально. Обычно для получения плазмы кровь центрифугируют со скоростью 310³ об/мин на цен­трифугах без охлаждения. Гомогенат ткани для энзимологических исследований центрифугируют со скоростью 7000–12000g при 0°С, в рефрижераторных центрифу­гах. Полученный после центрифугирования супернатант хранят в холодильнике при +4°С. Расчет объема супернатанта производят путем сложения величин объемов предварительно определенной в исследуемой раститель­ной или животной тканях гидровлаги и раствора, взято­го для экстракции ФАВ.

Качественный и количественный состав веществ, со­держащихся в супернатанте, определяют по стандарт­ным методикам. Следует придерживаться следующего правила при выборе методики: используемый метод дол­жен быть специфичным, т.е. исключать возможность побочных реакций, затрудняющих интерпретацию полученных результатов, и легко воспроизводимым.