Выявление гликогена кармином по методу Беста

Фиксация материала в жидкостях Буэна, Карнуа, спир­те. Заливка материала в целлоидин.

Необходимые материалы

1. Квасцовый гематоксилин.

2. 1%-ный солянокислый спирт.

3. Раствор кармина.

Приготовление раствора. Основной раствор: в 60 мл дис­тиллированной воды растворить 2 г кармина, 1 г углекислого калия и 5 г углекислого хлористого калия. Кипятить в тече­ние 5 мин, охладить, фильтровать. Добавить 20 мл 28%-ного раствора аммиака. Хранить при температуре 0—4°С.

Раствор для окрашивания: 8 мл основного раствора, 15,5 мл аммиака (уд. вес 0,880) и 24 мл метанола.

4. Раствор Беста: к 8 мл абсолютного спирта добавить 4 мл метанола и 10 мл дистиллированной воды.

Дистиллированная вода. Ход окраски

1. Окрашивают в квасцовом гематоксилине до 5 мин.

2. Ополаскивают в воде, отдифференцировывают окраску ядер в 1%-ном подкисленном спирте.

3. Ополаскивают в дистиллированной воде.

4. Помещают в карминовый раствор для окрашивания на 15—30 мин.

5. Дифференцируют в растворе Беста от нескольких секунд до нескольких минут.

6. Промывают в 80° спирте.

7. Обезводить, просветлить и заключить в бальзам.

Результаты окраски: ядра темно-синие, гликоген ярко-красный.

Примечание: кроме метода Беста для выявления гликогена, а также гликогена в соединении с углеводами существуют методы по Шабодашу, Мак-Манусу и ряд других.

Реакция Фельгена для выявления дезоксирибонуклеиновой кислоты (днк)

Фиксация кусочков из тканей и органов в 10%-ном нейт­ральном формалине или в смеси Карнуа. Заключение кусоч­ков в парафин.

Необходимые материалы

1. Соляная кислота.

2. Раствор Шиффа (приготовление см. с. 29).

1. Раствор бисульфита. К 5 мл 10%-ного раствора К2С2О5 добавить 5 мл 1 н соляной кислоты и долить воды до 100 мл.

3. Дистиллированная вода.

Ход окраски

1. Срезы быстро сполоснуть в холодной 1 н НС1 (соляная кислота).

2. Поместить срезы в 1 н НС1 при 60° (на водяной бане) на оптимальный срок гидролиза (3—10 мин.).

3. Быстро сполоснуть в 1 н НС1 и затем в дистиллирован­ной воде.

4. Перенести срезы в раствор Шиффа или фуксин-сернис­тую кислоту (в закрытом сосуде) на 1—2 часа.

5. Осушить и сполоснуть срезы в трех порциях свежепри­готовленного раствора бисульфита.

6. Сполоснуть в проточной воде (5—10 мин.).

7. Обезводить в спирте в течение 5—10 мин.

8. Просветлить в двух порциях ксилола по 3 мин. в каждой.

9. Заключить в бальзам.

Результаты окраски: ДНК окрашивается в различные от­тенки красновато-пурпурного цвета.

Метод Браше с применением метилового зеленого-пиронина и рибонуклеазы для выявления рибонуклеиновой кислоты (рнк)

Фиксация кусочков в 10%-ном нейтральном формалине или в смеси Гелли, Карнуа (4—16 часов). Заключение кусоч­ков в парафин.

Необходимые материалы

1. Раствор метилового зеленого-пиронина. Приготовить растворы А и В, смешать их перед употреблением в соотно­шении 1:1.

Раствор А: 17,5 мл 5%-ного водного раствора пиронина G, 10 мл 2%-ного водного раствора метилового зеленого, промы­того в хлороформе, и 250 мл дистиллированной воды.

Раствор В: М/5 ацетатный буфер с рН 4,8. Смесь раство­ров хранится не более недели.

2. Ацетон.

3. 1%-ный раствор рибонуклеазы.

Ход окраски

1. Окрасить срез раствором метилового зеленого — пиро­нина в течение 10 мин—24 часа.

2. Быстро сполоснуть срезы в дистиллированной воде.

3. Высушить досуха фильтровальной бумагой.

4. Быстро обезводить в абсолютном ацетоне (10—15 сек).

5. Быстро сполоснуть в смеси равных объемов ацетона и ксилола (10—15 сек).

6. Быстро сполоснуть в 10%-ном растворе ацетона и кси­лола.

7. Просветлить в двух порциях (1—2 мин) чистого ксило­ла по 10 мин в каждой.

8. Заключить в канадский бальзам, но лучше в дистриндибутилфталатксилол.

Контрольные срезы: для проверки метода неокрашенные срезы, предварительно фиксированные смесью Гелли или Кар­нуа, обрабатывают 1%-ным раствором рибонуклеазы при тем­пературе 60°—65°С (термостат) в течение 90 мин.

Результат окраски: РНК окрашивается в розово-красный цвет, а ядра в сиреневый