Исследование хромосом в метафазе

Наиболее подходящей стадией клеточного цикла для тон­кого исследования хромосом является метафаза митоза. Ма­териалом в этом случае служит источник ткани, обладающий достаточной митотической активностью (костный мозг, лим­фатические узлы, эмбриональные ткани и др.)- Этот метод был разработан Фордом и с тех пор многократно видоизме­нялся. Ниже мы приведем один из вариантов метода для ра­боты с лабораторными и другими животными.

Необходимые материалы

1. Колхицин или его аналог колцемид.

2. 1%-ный или 1,12%-ный раствор лимоннокислого натрия гипотонический раствор).

3. Метиловый спирт.

4. Ледяная уксусная кислота.

5. Уксуснокислый орсеин. 2 г орсеина растворяют в 100 мл 45%-ной уксусной кислоты.

6. Дистиллированная вода.

Приготовление и окраска препаратов

Примерно за 2 часа до убоя животного ему внутрибрюшинно или подкожно вводят водный раствор колхицина из расчета 1 гамма (миллионная доля грамма) колхицина на 1 г веса.

Колхицин блокирует образование веретена деления на стадии метафазы, и поэтому в ткани накапливаются клетки, остановившиеся в своем делении на стадии метафазы.

Животных убивают. Костный мозг из бедренных костей вымывают при помощи шприца 1%-ным или 1,12%-ным рас­твором лимоннокислого натрия. Ткани селезенки, лимфати­ческих узлов, тимуса и др. тщательно измельчают в чашке Петри с гипотоническим раствором.

Суспензию клеток собирают в центрифужные пробирки (вместе с гипотоническим раствором) и инкубируют в термос­тате при Т=37°С 20—40 мин.

Затем взвесь осаждают центрифугированием 3—5 мин при 800—1000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют фиксатор, состоящий из смеси метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в пропорции

3:1. Фиксируют 1,5—2 часа. Во время фиксации фиксатор меняют 2—3 раза. Меняя фиксатор, следят, чтобы глыбка клеток не разбивалась, а слой клеток был тонким для лучшей фиксации. Фиксатор наливают каждый раз по 1,5—2 мл. По окончании фиксации взвесь клеток ресуспензируют в неболь­шом объеме фиксатора (0,5 мл). 2—3 капли суспензии наносят на предметные стекла, предварительно охлажденные сухим льдом или хранящиеся в дистиллированной воде в холодильнике.

Затем стекло подсушивают над пламенем горелки. Фикса­тор высыхает, а клетки прочно приклеиваются к стеклу.

Мазки окрашивают 1%-ным расвором ацетоорсеина в те­чение 5—10 мин, после чего краску смывают водой и высуши­вают при комнатной температуре.

Анализ препаратов хромосом проводят на микроскопе при увеличении 7X90, соблюдая следующие условия: 1) изучают клетки, находящиеся на стадии метафазы, хромосомы кото­рых расположены в одной плоскости и могут быть легко сос­читаны; 2) исследуют лишь разрушенные метафазные плас­тинки с сохранившимися контурами клетки. Пластинки фо­тографируют и составляют идиограммы из вырезанных хро­мосом метафазных пластинок; гомологичные хромосомы рас­полагают попарно в направлении уменьшения размеров их плечей, длина которых предварительно измеряется.

Исследование хромосом в стадии анафазы

Исследование хромосом в стадии анафазы проводят с целью получения количественных и некоторых качественных данных относительно митотической активности, хромосомных и геномных перестроек.

Необходимые материалы

1. Жидкость Карнуа (см. с. 9).

2. Этиловый спирт.

3. Ацетокармин. Смешивают 45 см³ ледяной уксусной кислоты с 55 см³ дистиллированной воды и прибавляют 5 г кармина в порошке. Затем 30—60 мин кипятят на малом ог­не (можно добавить одну каплю гидроокиси железа). Перед употреблением фильтруют;

4. Раствор хлоралгидрата. 5 г хлоралгидрата растворяют в 2 см³ дистиллированной воды.

Приготовление и окраска препаратов. Материал для ис­следования берут немедленно после убоя животного и фикси­руют 3—4 часа в жидкости Карнуа. После фиксации матери­ал переносят в 96° этиловый спирт, где он хранится.

Мелко расщепленная ткань окрашивается в ацетокармине 5—24 часа.

Окрашенная ткань помещается в каплю раствора хлорал­гидрата на предметном стекле, где дополнительно расщепля­ется. Затем окрашенный и расщепленный материал накры­вают покровным стеклом и через несколько слоев фильтро­вальной бумаги пальцем или другим предметом строго пер­пендикулярно к предметному стеклу давят на покровное стек­ло. Окрашенная ткань распластывается широким веером кле­ток.

Лишняя краска удаляется фильтровальной бумагой, а края покровного стекла заливают парафином, предохраня­ющим от высыхания окрашенные клетки.

Полученные тотальные, но временные, ацетокарминовые препараты используются в течение 2—3 суток при хранении их в холодильнике.

Анализ препаратов и подсчет клеток проводятся при 400-кратном увеличении микроскопа.

При этом выявляют все клетки, находящиеся на стадии деления—метафазы, анафазы и ранней телофазы. Кроме того, подсчитывают клетки с различными хромосомными реор­ганизациями — мосты, фрагменты и др., и геномными перест­ройками — многополюсные метафазы и анафазы, метафазы с фрагментами и др. Данные подсчетов каждого случая прото­колируются, а затем вычисляются показатели цитогенетичес-кого анализа: индекс митотической активности в % (можно вычислять и в промиллях %₀ как отношение всех делящихся клеток к общему их числу; индекс хромосомной изменчивости в % как отношение числа измененных хромосом к общему числу анафаз; индекс геномных изменений в % ^как отноше­ние числа клеток с 3-х и 4-полюсными метафазами и анафа-в % ^как отношение числа измененных хромосом к общему числу анафаз; индекс мутационного давления в % ^как отно­шение хромосомных перестроек и генотипических изменений к общему числу анафаз.