Микроскопическое исследование и патогистологическая техника.

Микроскопическое исследование трупа — очень важный момент: оно дополняет вскрытие, а при ряде заболеваний дает возможность поставить правильный диагноз; оно совершенно необходимо при неясной картине вскрытия. Исследованию подвергают кровь, различные органы, ткани, патологические образования (например, опухоли), содержимое тех или других полостей (экссудаты, транссудаты), секреты желез, выделения из органов и пр.

Все эти материалы можно изучать в свежем состоянии и в виде фиксированных и окрашенных мазков и препаратов как в процессе самого вскрытия, так и через некоторое время. Желая гистологически исследовать какой-либо орган, из него вырезают кусочки в виде пластинок толщиной 0,5 см и фиксируют в 10% формалине (1 часть продажного формалина на 10 частей воды) или какой-либо другой фиксирующей жидкости. Кусочки принято вырезать из разных мест органа, прежде всего из тех, которые дают картину неясных изменений, а также из участков измененной и нормальной ткани. Еще лучше одновременно сохранить весь орган, а в случаях необычных, уклоняющихся от общего типа, оставлять все органы, чтобы впоследствии иметь возможность произвести дополнительные исследования и полностью восстановить действительную картину.

Изучая патологический материал в свежем состоянии, пользуются препаратами, изготовленными различными способами, а именно: мазками, расщипанными, раздавленными препаратами, висячей каплей и, наконец, срезами, полученными бритвой от руки или на замораживающем микротоме: мазки делают из органов мягкой консистенции (селезенка, лимфатические узлы, мозг, некоторые опухоли и т. д.) путем соскабливания ткани с поверхности их разреза, а также из крови трупа и различных патологических скоплений.

Раздавленные препараты применяются при исследовании мышц на трихины, саркоспоридии, пузырчатые глисты; расщипанные при желании изолировать отдельные элементы ткани, например мышечные волокна, клетки опухоли и т. д. (исследуемый объект при помощи иголок расщипывают в капле физиологического раствора на предметном стекле до едва видимых частиц).

Правила взятия материала для патологогистологического исследования

1. Материал следует брать от свежих трупов не позднее 12 часов после смерти (убоя) животного, т. е. до наступления процессов аутолиза и гниения.

2. Материал должен быть взят: от каждого органа, где обнаружены макроскопические видимые изменения, а также от главнейших внутренних органов.

3. От каждого патологически измененного органа нужно брать несколько кусочков из различных мест поражения.

4. В вырезанном для исследования кусочке, кроме измененного участка, должна быть нормальная ткань.

5. Вырезанные кусочки должны представлять собой пластинки толщиной не более 0,5—1 см.

6. Материал должен фиксироваться немедленно и непосредственно после взятия.

7. Следует избегать размозжения кусочков ткани, для этого необходимо пользоваться острыми инструментами (бритвы, секционные ножи). Ножницами лучше пользоваться при взятии материала из тонкостенных полых органов (кишечник, желчный пузырь и др.). Кусочки кости лучше выпиливать лобзиком.

8. Следует избегать обмывания и очистки поверхностей органов, из которых иссекается кусочек.

9. Учет взятого материала для исследования ведут в журнале, где кратко описывают, от какого животного и органа взят материал.

Фиксация материала

Первым и обязательным условием в патологогистологической технике является предупреждение и задержка развития посмертных изменений (аутолиза и гниения) в тканях и органах. Таким образом, фиксация — это закрепление тканевых структур в том виде, в каком они были в момент взятия патологического материала. Взятые кусочки фиксируют путем обработки их в фиксирующих жидкостях.

Сущность фиксации окончательно не выяснена. Известно лишь, что при этом происходит коллоидная реакция превращения тканевых белков из золя в гель, т. е. коагуляция (свертывание) их без грубых нарушений структуры клеток.

Фиксирующие жидкости по-разному оказывают влияние на различные нормальные и патологические компоненты ткани и органов. Поэтому в каждом конкретном случае выбирают фиксаторы в зависимости от целей и задач исследования. Профиксированный материал можно сохранять длительное время. Недостатком метода фиксации является некоторое искажение структуры органа (уплотнение, сморщивание и др.). Искажение истинной структуры органа называется артефактом, который корректируется наблюдением свежих объектов, использованием различных фиксаторов.

Фиксирующие жидкости разделяют на простые и сложные. Простые фиксирующие жидкости состоят из одного химического вещества (формалин, спирт, ацетон). В состав сложных фиксирующих жидкостей входит несколько веществ, и называется она по имени автора, например, жидкость Мюллера, Орта, Карнуа и др.

Общие правила фиксации материала

1. Материал фиксируется непосредственно и немедленно после взятия.

2. Для фиксации материала следует употреблять стеклянную, керамическую или полиэтиленовую посуду (избегать металлическую).

3. Объем фиксирующей жидкости должен в 5—10 раз превышать объем фиксируемого материала.

4. Для лучшего и равномерного проникновения фиксатора по всей толще кусочка его погружают в сосуд с фиксирующей жидкостью, на дно которого необходимо положить вату.

5. Фиксирующая жидкость меняется каждые сутки до тех пор, пока не станет прозрачной.

6. Материал снабжается этикеткой из плотной бумаги (фотобумага, ватман). Краткие сведения о патологическом материале на этикетке пишут графитным карандашом или тушью (рис. 2).

7. Фиксирование производится без доступа света.

8. Повышенная температура ускоряет фиксацию. Оптимальная температура фиксации +37°С. Для некоторых фиксаторов необходима более низкая температура (до 0°С).

Самым распространенным, доступным и эффективным фиксатором является формалин, который представляет собой 40%-ный водный раствор газа формальдегида (альдегид муравьиной кислоты, НСНО)

Правила фиксации материала в формалине

1. Формалин хранится в темном помещении или в темной посуде при температуре не ниже +9°С.

2. Продажный формалин нейтрализуют прибавлением сухого мела или углекислой магнезии до 1/10—1/20 его объема.

3. Рабочей фиксирующей жидкостью является 10—20%-ный водный раствор формалина: нейтрального формалина — 10—20 см³, воды водопроводной — 90—80 см³. Разводить формалин дистиллированной водой не рекомендуют, т. к. она имеет слабокислую реакцию, вследствие чего вызывает набухание тканей.

4. Показателем окончания фиксиции в формалине является исчезновение кровавой окраски в глубоких частях фиксируемого объекта (приблизительно 24—48 час).

5. Иногда применяют метод экстренной фиксации:

• кусочек материала толщиной менее 0,5 см помещается в пробирку с 20%-ным водным раствором формалина;

• нагревается на пламени газовой горелки или спиртовки в течение 3—5 минут до появления пузырьков (не кипятить).

Достоинства фиксации материала в формалине

1. Простота метода.

2. Достигается хорошая сохранность гистроструктур, а также возможность сохранения объектов довольно долгое время.

Недостатки метода

1. Невозможность выявления веществ, растворимых в воде (гликоген, мочевая кислота и др.)

2. Не удается четко обнаружить тонкие цитологические структуры.

Для выявления веществ, растворимых в воде, применяют безводные фиксаторы (спирт, ацетон). Этиловый спирт употребляют как абсолютный, так и 96° этиловый спирт. Время фиксации продолжается от 2 до 24 час, в зависимости от толщины исследуемого объекта. При этом удается сохранить такие вещества, как муцины, гликоген, мочевую кислоту, железо, кальций. Вместе с тем спирт вызывает некоторое сморщивание клеток в результате быстрого отнятия воды, растворяет жиры и гемоглобин. Метиловый спирт (метанол) применяют для цитологических исследований в качестве фиксатора мазков крови и отпечатков с органов и тканей. Метанол — сильный яд, хранится по правилам ядовитых веществ группы А. Ацетон применяется при необходимости быстрого фиксирования ткани. Толщина фиксируемых объектов 3—4 мм, время фиксации 2—3 часа.

Для выявления тонких цитологических структур употребляются сложные фиксирующие жидкости.

1. Жидкость Мюллера

Рецепт: Двухромовокислого калия — 2,5; Сернокислого натра — 1,0; Дистиллированной воды — 100,0. Продолжительность фиксации 1—6 недель (при t=37°, 1—2 недели — с ежедневной сменой жидкости).

2. Жидкость Орта

Рецепт: Жидкости Мюллера — 90,0; Формалина продажного— 10,0. Продолжительность фиксации 1—2 суток.

3. Жидкость Ценкера

Рецепт: Жидкость Мюллера— 100,0; Сулемы — 5,0; Уксусной кислоты — 5,0

(добавляется перед употреблением). Продолжительность фиксации 6—12 часов.

Примечания.

1. После окончания фиксации промывка в воде 24 часа.

2. Освобождение от сулемы в 70° спирте.

3. Хранится фиксированный материал в 70° спирте.

4. Жидкость Карнуа

Рецепт: Спирта абсолютного — 60,0; Хлороформа — 30,0; Уксусной ледяной кислоты— 1G,O (extempore). Продолжительность фиксации 2—4 часа, после чего кусочки переносят в чистый спирт (96° или абсолютный).

5. Жидкость Буэна

Рецепт: Насыщенного водного раствора пикриновой кислоты — 75,0; Формалина (неразведенного) — 25,0; Ледяной уксусной кислоты — 5,0. Жидкость готовится перед употреблением. Продолжительность фиксации от 1 до 24 часов в зависимости от толщины объекта.