Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях

ДНК-полимераза	Частота мутаций (на 1 нуклеотид/1 раунд репликации)
Pfu	1,3 10^-6
Deep Vent	2,7 10^-6
Vent	2,8 10^-6
Taq	8,0 10^-6
exo(-)Pfu и UITma	5,0 10^-5
Смесь Taq/Pfu или Klentaq/Pfu	5 10^-6

ошибочно спаренных нуклеотидов праймера и ДНК-матрицы одинаково эффективно предотвращают синтез ДНК Taq-полимеразой. По способности направлять синтез ДНК все такие пары 3’-концевого нуклеотида праймера и соответствующего нуклеотида матричной ДНК располагаются в следующий ряд: C–C, A–G, G–A, G–G < A–A < T–C, C–T, T–T << A–C, C–A << G–T, T–G (данные фирмы "Cetus"). При этом наименее благоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин–пурин и пиримидин–пиримидин.

РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы, ревертазы). Обратные транскриптазы способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, полимеризуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, как это имеет место в случае ДНК-зависимых ДНК-полимераз. Обратные транскриптазы, так же как и ДНК-полимеразы функционируют только при наличии затравки. Широко используемая в генной инженерии обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц помимо полимеризующей активности обладает 5’3’- и 3’5’-экзорибонуклеазными активностями и расщепляет РНК в ДНК-РНК-гибридах по процессивному механизму. Обратные транскриптазы находят применение в синтезе двухцепочечных ДНК, комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в плазмидных векторах при получении библиотек (клонотек) кДНК (см. раздел 7.3). Обратные транскриптазы, подобно ДНК-полимеразам, могут быть использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНК-зонды в составе соответствующим образом меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Недавно способность синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях была продемонстрирована для термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus. Это позволяет использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР. Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).

4. Другие ферменты

Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклеотидкиназы, которые осуществляют перенос -фосфатных групп ATP на 5’-OH группы ДНК или РНК. Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 широко используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно меченных зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.

Терминальная трансфераза из тимуса теленка (терминальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза), осуществляющая последовательное присоединение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов из пула дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к 3’-OH-группам молекул ДНК, используется для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов в 3’-концы ДНК, а также присоединения к 3’-концам фрагментов ДНК (особенно кДНК) протяженных гомополимерных последовательностей нуклеотидов (коннекторов) для последующего их клонирования.

Щелочные фосфатазы бактерий (BAP) и кишечника теленка (CIAP) катализируют удаление 5’-фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5’-концевой радиоактивной метки ³²Р, а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5'-концевого фосфата. Удаление 5'-концевых фосфатных групп молекул вектора, лианеризованных с помощью одной рестриктазы во время его подготовки для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки.

В заключение следует рассмотреть некоторые нуклеазы, часто используемые в генной инженерии. Нуклеазы – это гидролитические ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты. По механизму расщепления субстратов нуклеазы разделяют на экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осуществляют последовательное отщепление моно- или небольших олигонуклеотидов с концов молекул ДНК или РНК, тогда как эндонуклеазы вносят в молекулы нуклеиновых кислот внутренние разрывы. В частности, к эндонуклеазам относятся многочисленные рестриктазы, рассмотренные выше. Некоторые нуклеазы обладают более широкой специфичностью и могут гидролизовать как РНК, так и ДНК, а также одновременно проявлять эндо- и экзонуклеазную активности. Нуклеаза Bal31 из Alteramonias aspejiana последовательно отщепляет отдельные моно- и олигонуклеотиды с 5’- и 3’-концов двухцепочечных ДНК, укорачивая обе цепи ДНК приблизительно с равной скоростью. При этом нуклеаза Bal31 гидролизует и одноцепочечные ДНК.

Экзонуклеаза III E. coli катализирует последовательное отщепление 5’-нуклеотидов из двухцепочечных ДНК в направлении 3’5’. Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, активностью РНКазы H (гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах) и 3’-фосфатазной активностью.

Экзонуклеаза фага  катализирует последовательное отщепление 5’-мононуклеотидов в двухцепочечных ДНК при наличии в них 5’-концевых фосфатных групп. Ее используют для получения одноцепочечных молекул ДНК с целью их последующего секвенирования.

Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae специфически расщепляет одноцепочечные молекулы ДНК с образованием 5’-фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой фасоли (mung bean).

Панкреатическая рибонуклеаза A (РНКаза A) обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами. Продуктами гидролиза являются 3’-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3’-монофосфаты.

Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5’-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg²⁺ ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а в присутствии ионов Mn²⁺ расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга.

Рассмотренные ферменты не исчерпывают всего списка белков, используемых в генной инженерии. Особенности применения многих из этих ферментов для решения конкретных генно-инженерных задач будут не раз обсуждаться при дальнейшем изложении принципов генной инженерии.