- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
Анализ структуры генома современных эукариот показывает, что эволюционные преобразования генома-предшественника, приведшие к включению в него избыточных последовательностей нуклеотидов, сопровождались важными генетическими изменениями в отношении стабилизации генетической информации. В частности, многократное превышение содержания избыточных последовательностей нуклеотидов над кодирующими неизбежно должно приводить к соответствующему уменьшению вероятности возникновения мутаций в кодирующих и других функционально значимых частях под действием внутриядерных мутагенов эндогенного и экзогенного происхождения. Поскольку в разных частях интерфазного ядра (микрокомпартментах, заключающих в себе хромомеры интерфазных хромосом) наблюдается гетерогенность в уровнях конденсации хроматина, индивидуальные локусы могут быть по-разному защищены от мутационных изменений, вызываемых мутагенами. Рассмотрим более подробно влияние избыточных последовательностей ДНК генома эукариот на стабильность их генома.
Рис. I.63. Гипотетическое эволюционное преобразование генома-предшественника путем включения в него некодирующих избыточных последовательностей нуклеотидов
Влияние избыточных последовательностей нуклеотидов на число мутаций, возникающих в результате ошибок репликации в кодирующих последовательностях генома. Предположим, что длина исходного генома, не содержащего избыточных последовательностей нуклеотидов, составляет N п.о. (см. рис. I.63). При этом в результате ошибок репликации в нем, в среднем, возникает a мутаций независимо одна от другой и случайным образом. Допустим, что в ходе эволюционных преобразований в него включаются избыточные последовательности нуклеотидов, суммарная длина которых составляет nN п.о. и, соответственно, общая длина преобразованного генома становится равной (n+1)N п.о. Поскольку число мутаций, возникающих в результате ошибок репликации, прямо пропорционально длине реплицирующейся ДНК, общее количество мутаций, в среднем, возникающих в преобразованном геноме при участии этого механизма, должно возрасти в n+1 раз и составить a(n+1). Вероятность возникновения одной независимой и случайной мутации в некодирующей части генома P(1) будет пропорциональна его длине:
P(1) = =. (1)
В то же время вероятность возникновения в избыточных частях генома всех a(n+1) мутаций будет равна:
P[a(n+1)] = (2),
поскольку вероятность одновременного наступления a(n+1) независимых событий равна произведению вероятностей наступления каждого из них в отдельности. При a = 1 (т.е. в том случае, если в процессе репликации исходного генома в нем, в среднем, возникала одна мутация) и достаточно больших значениях n это выражение стремится к e-1, т.е. к 0,36. Таким образом, в данном случае при n = 100 (что, приблизительно, соответствует соотношению некодирующих и кодирующих последовательностей нуклеотидов в геноме человека и других млекопитающих) вероятность того, что ни одна из мутаций, возникающих в гипотетическом преобразованном геноме в результате ошибок репликации, не произойдет в его кодирующих частях, будет довольно высокой и составит 0,37. Это означает, что, в среднем, каждая третья дочерняя соматическая или половая клетка, возникшая в результате редупликации гипотетического генома с достаточным количеством некодирующих избыточных последовательностей нуклеотидов, будет полностью свободна от мутаций, образующихся по такому механизму в кодирующих частях своего генома.
С увеличением числа мутаций в исходном геноме-предшественнике (a >> 1) вероятность возникновения всех мутаций в некодирующих частях генома быстро уменьшается. Однако поскольку эти мутации будут распределяться между кодирующими и некодирующими частями генома пропорционально длине каждой из этих частей, общее их количество в кодирующих частях генома останется неизменным. Следовательно, эволюционное включение в геном-предшественник большого количества некодирующих последовательностей нуклеотидов не увеличивает число мутаций, возникающих в кодирующих частях генома в результате ошибок репликации. Более того, в ряде случаев такое эволюционное преобразование генома может заметно стабилизировать его генетическую информацию.
Влияние избыточных последовательностей нуклеотидов на число мутаций, возникающих в кодирующих частях генома под действием мутагенов. Ситуация, связанная с возникновением мутаций в гипотетическом геноме под действием мутагенов экзогенного и эндогенного происхождения, принципиально отличается от только что рассмотренной (см. рис. I.63). Если предположить, что эволюционное преобразование генома, приведшее к включению в него n некодирующих последовательностей нуклеотидов, не сопровождается увеличением числа внутриядерных мутагенов, то генетические последствия такого преобразования будут гораздо более значительными.
Так же как и в предыдущем случае, вероятность попадания одного мутагена Mk в некодирующую область гипотетического генома равна . Вероятность же того, что всеk мутагенов попадут в некодирующие области нового генома P(k), равна:
P(k) = (3).
При больших значениях n и малых k величина P(k) стремится к 1,0, т.е. имеет место событие, близкое к достоверному. Иными словами, чем больше доля некодирующих последовательностей нуклеотидов в геномной ДНК, тем вероятнее, что все внутриядерные мутагены попадут в некодирующие последовательности. В случае гипотетического генома с n = 100 вероятность попадания одного мутагена в кодирующую область становится равной 0,01, т.е. весьма малой. При этом общее число мутагенов, которые будут взаимодействовать с кодирующими последовательностями нуклеотидов, уменьшится в 100 раз и будет иметь место 100-кратная защита кодирующих функционально значимых участков эволюционно преобразованного генома от мутаций, вызываемых внутриядерными мутагенами, по сравнению с исходным геномом-предшественником. При k = n+1 с ростом n уравнение (3) будет стремиться к e-1, т.е. к ~0,36, и быстро уменьшаться при дальнейшем увеличении k. Но это относится к вероятности полной защиты кодирующих последовательностей нуклеотидов. Относительная же защита, равная доле химических мутагенов из всего их пула, взаимодействующих с кодирующими последовательностями нуклеотидов, будет обратно пропорциональна общей длине избыточных последовательностей в преобразованном геноме, т.е. обратно пропорциональна n. Относительная защита генома от химических мутагенов может быть особенно актуальной в условиях экологического стресса.
Насколько соответствует действительности предположение о том, что эволюционное преобразование генома-предшественника путем включения в него большого количества избыточных последовательностей нуклеотидов не будет сопровождаться пропорциональным возрастанием количества внутриядерных мутагенов? Очевидно, что такое предположение является упрощением. Увеличение внутриядерного содержания ДНК, например в результате эндорепликации при политении, по-видимому, всегда приводит к пропорциональному увеличению объема соответствующих ядер, следствием чего, казалось бы, должно быть пропорциональное возрастание количества молекул внутриядерных мутагенов. Однако это не совсем так. Данный вывод относится лишь к мутагенам, непосредственно образующимся в ядре, например в результате взаимодействия ионизирующего излучения с веществом ядер. Большая же часть мутагенов, по-видимому, должна поступать в ядра из цитоплазмы путем радиальной диффузии через ядерные мембраны. При этом одним из факторов, ограничивающих попадание мутагенов из цитоплазмы в ядра, является их поверхность, поскольку вероятность контакта мутагенов цитоплазмы с ядром прямо пропорциональна площади его поверхности. При увеличении объема поверхность ядра-шара возрастает пропорционально квадрату его радиуса, тогда как объем – пропорционально кубу радиуса ядра. Следовательно, объем ядер будет увеличиваться быстрее площади их поверхности и количество молекул внутриядерных химических мутагенов, приходящихся на нуклеотид ядерной ДНК, должен уменьшаться при возрастании ядерного объема за счет увеличения содержания ядерной ДНК. Такое эволюционное преобразование генома в целом будет сопровождаться повышением его информационной стабильности.
Включение в геномную ДНК некодирующих последовательностей может приводить и к более специфической защите жизненно важных локусов генома от химических мутагенов. В частности, глобальная защита кодирующих последовательностей от химических мутагенов, поступающих из цитоплазмы в ядро путем радиальной диффузии, могла бы происходить в том случае, если бы некодирующие последовательности были преимущественно локализованы вблизи поверхности ядер и экранировали последовательности, расположенные ближе к их центральной части. В настоящее время имеются многочисленные экспериментальные данные, указывающие на высокоупорядоченное расположение последовательностей нуклеотидов ДНК в интерфазных ядрах. Значение пространственного расположения отдельных последовательностей ДНК интерфазных хромосом для избирательной, специфической защиты кодирующих последовательностей будет подробнее рассмотрено ниже.