- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Пространственная организация синтеза мРнк
Внутриядерный синтез мРНК и доставка зрелых транскриптов к месту их трансляции требуют участия множества тонко сбалансированных во времени, пространственно организованных молекулярных механизмов. Выше уже были рассмотрены основные молекулярные процессы, обеспечивающие сборку инициационных и элонгирующих нуклеопротеиновых комплексов, а также механизмы котранскрипционных и посттранскрипционных модификаций РНК, включая кэпирование, сплайсинг, редактирование их первичной структуры и полиаденилирование. Теперь кратко суммируем известные факты о внутриядерной компартментализации этих процессов.
Аппарат транскрипции, участвующий в синтезе пре-мРНК, ассоциирован с перихроматиновыми фибриллами, обнаруживаемыми на границах доменов конденсированного хроматина. Эти фибриллы представляют собой ядерные рибонуклеопротеиновые комплексы диаметром 3–20 нм. Они включают в себя растущие цепи пре-мРНК, и плотность фибрилл коррелирует с транскрипционной активностью соответствующих участков хроматина. С помощью иммунохимических методов здесь же обнаружены компоненты аппарата сплайсинга, который удаляет интроны из предшественников мРНК одновременно с элонгацией транскриптов.
В опытах по внутриядерной локализации мест синтеза специфических транскриптов с использованием импульсной радиоактивной или флуоресцентной меток такие РНК были обнаружены в виде "треков" или более компактных "точек" в одном или двух дискретных участках ядра, что соответствует копиям соответствующих генов на гомологичных хромосомах. При этом с использованием одновременной гибридизации ДНК и РНК было показано, что транскрибируемые гены расположены прямо в треках или точках на одном из концов трека. Более того, зонды, специфичные в отношении последовательностей интронов, метят треки только вблизи гена, указывая на то, что сплайсинг происходит вдоль этого следа РНК.
Треки РНК тесно ассоциированы с дискретными внутриядерными структурами, называемыми межхроматиновыми гранулами, или спеклами. Спеклы обогащены компонентами аппарата сплайсинга, а также содержат интронсодержащие пре-мРНК и полиаденилированные молекулы. В соответствии с этим спеклы могут представлять собой места процессинга пре-мРНК и аккумуляции зрелых мРНК внутри ядер. В ряде случаев выявляется неслучайная ассоциация активно транскрибируемых генов со спеклами, которые могут маркировать внутриядерные области транскрипции. Противоречивость этой интерпретации заключается в том, что в ядре обнаруживаются одновременно всего 20–50 спеклов, тогда как транскрибирующихся генов значительно больше. Следовательно, не каждый транскрибируемый ген ассоциирован с такими структурами. Большинство экспериментальных доказательств ассоциации мест транскрипции со спеклами получено для особо активных генов, например гена коллагена, транскрипты которого в фибробластах составляют до 4% суммарной РНК. Возможно, спеклы представляют собой микрокомпартменты, в которых происходит процессинг РНК наиболее активно транскрибируемых генов.
После завершения синтеза и объединения с компонентами аппарата сплайсинга, формирующими сплайсомы, пре-мРНК переносится к ядерной оболочке и выходит в цитоплазму. Выход РНК из ядра в цитоплазму осуществляется через поры в ядерной оболочке, входящие в состав ядерного порового комплекса (NPC). NPC является постоянно существующим микрокомпартментом, однозначно идентифицируемым с помощью микроскопических, генетических и биохимических методов.
Во время внутриядерного транспорта молекулы РНК объединяются с другими белками, участвующими в их процессинге, образуя гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиновые комплексы (гяРНП), в которых пространственная структура пре-мРНК оптимизирована для ее созревания. Ядерный матрикс, получаемый в результате удаления из ядер большей части хроматина, все еще содержит пре-мРНК, гяРНП и некоторые компоненты аппарата сплайсинга. Это может указывать на внутриядерную избыточность гяРНП и их роль в формировании пространственной структуры ядер. В общем, для гяРНП характерно диффузное распределение в нуклеоплазме, однако часть из них может концентрироваться в окрестностях спеклов и даже следовать за РНК из ядра в цитоплазму и вновь возвращаться в ядра вместе с транскриптами.
Процесс перемещения специфических пре-мРНК от генов в цитоплазму клеток был подробно исследован в случае экспорта частиц пре-мРНП колец Бальбиани комара Chironomus tentans, экспрессирующиеся гены которых находятся в составе гигантских пуффов политенных хромосом слюнных желез. Крупные транскрипты этих пуффов во время элонгации упаковываются в гяРНП в виде тонких фибрилл, которые по мере удлинения пре-мРНК становятся толще и изгибаются с образованием кольцеобразных структур. Зрелые гранулы пре-мРНП, которые, как полагают, заключают в себе РНК, претерпевшую сплайсинг, движутся в нуклеоплазме к ядерной оболочке, где задерживаются вблизи ядерных пор. В это время они приобретают форму палочек, которые проходят через ядерные поры, начиная с 5’-конца заключенной в них РНК. Как только пре-мРНК появляются на поверхности цитоплазматической части ядерной мембраны, они объединяются с рибосомами. Следует подчеркнуть, что на протяжении всей этой цепи событий РНК находится в составе пространственно упорядоченных РНП-частиц. Накапливаются данные в пользу того, что перемещение РНК от гена к ядерной мембране не является следствием простой диффузии. Такому простому объяснению, в частности противоречат факты тесной ассоциации транскриптов, гяРНП и компонентов аппарата сплайсинга с ядерным матриксом. В ряде случаев находит подтверждение гипотеза ядерной фиксации генов (gene gating model), предложенная Г. Блобелом (1985 г.), в соответствии с которой конкретные гены функционально связаны с определенными участками (и порами) ядерной мембраны, что направляет их транскрипты для экспорта в цитоплазму к этим конкретным участкам. Однако такое правило подтверждается не всегда. В частности, РНК коллагена обнаруживают распределенной вдоль всей ядерной мембраны, что указывает на ее выход в цитоплазму через многие ядерные поры.
Для рассмотренных выше структур, образование которых сопровождает синтез, процессинг и экспорт РНК из ядра в цитоплазму, характерен динамизм – отдельные их компоненты могут перемещаться между микрокомпартментами. Синтез, процессинг и транспорт РНК в ядре происходят в составе дискретных компартментов нуклеоплазмы, что позволяет концентрировать регуляторные, структурные и ферментативные компоненты транскрипции и сплайсинга в местах активно экспрессирующихся генов. Действительно, все этапы сплайсинга можно воспроизвести в разбавленных растворах in vitro при концентрации белка 1 мкг/мл. Однако скорость этих реакций в таких системах значительно ниже наблюдаемой in vivo, где внутриядерная концентрация РНП превышает 50 мг/мл. Кроме того, пространственно упорядоченная организация ранних этапов экспрессии генов создает необходимые условия и дополнительные уникальные возможности для ее регуляции, что было бы невозможно в случае свободной диффузии компонентов этой системы.