- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Мутаторный фенотип
Несмотря на обилие эндогенных и экзогенных мутагенов, лишь небольшая часть их взаимодействий с ДНК завершается образованием мутаций. Для того чтобы исходное повреждение ДНК в виде аддукта, апуринового сайта или одноцепочечного разрыва закрепилось в геноме в виде мутации, ему необходимо избежать нейтрализующего действия многочисленных ферментов системы репарации ДНК. В экспериментальных условиях для получения требуемых мутаций с помощью химических мутагенов и последующего скрининга требуется большая доза суммарного мутагенного воздействия. Из экспериментальных кривых "доза–эффект" видно, что число возникающих мутаций прямо пропорционально дозе мутагенного воздействия. Исходя из этого уже a priori можно предположить, что повреждение отдельных компонентов системы репарации должно приводить к возрастанию выхода мутаций в ответ на определенную дозу мутагенного воздействия. Действительно, описаны многочисленные штаммы микроорганизмов и линии соматических клеток с повышенными частотами спонтанных мутаций. Совокупность признаков организма, для которой характерна повышенная частота образования спонтанных мутаций, получила название мутаторного фенотипа.
Исследование молекулярно-генетических механизмов, приводящих к формированию мутаторного фенотипа, позволило обнаружить отдельные гены, ответственные за этот процесс. Такие гены называют генами-мутаторами, или просто мутаторами. Прежде всего, к ним относятся многие гены системы репарации ДНК, контролирующие разные ее этапы (подробнее см. раздел 5.3). Другие гены, мутации в которых приводят к мутаторному фенотипу, кодируют ферменты матричного синтеза нуклеиновых кислот. Описаны мутационные замены отдельных аминокислотных остатков в ДНК-полимеразах, которые понижают специфичность выбора дезоксирибонуклеозидтрифосфатов из внутриклеточного пула в соответствии с последовательностью матричной ДНК. Следствием этого является повышение частоты включения некомплементарных матрице нуклеотидов в строящиеся цепи ДНК. Однако сам процесс включения некомплементарных матрице нуклеотидов является лишь одной из стадий, критических для контроля точности репликации ДНК. Благодаря наличию у ДНК-полимераз корректирующей 3’→5’-экзонуклеазной активности ошибочно включенные некомплементарные матрице нуклеотиды тотчас удаляются из строящейся цепи ДНК, что защищает ее от точковых мутаций, возникающих по такому механизму. Поэтому неудивительно, что мутации, нарушающие функционирование корректирующей экзонуклеазной активности, также приводят к возникновению мутаторного фенотипа. К аналогичным эффектам приводят нарушения функционирования систем рекомбинации, транскрипции, систем контроля структуры хроматина, ферментных систем, контролирующих сегрегацию хромосом и число копий индивидуальных генов, а также систем, участвующих в синтезе эндогенных мутагенов. Нарушения функционирования и координации экспрессии генов метаболизма нуклеотидов также приводят к мутаторному фенотипу. Известно, что повышение внутриклеточной концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов сверх оптимального уровня понижает точность репликации ДНК. Мутаторный фенотип после возникновения начинает имитировать непрерывное мутагенное воздействие, интенсивность которого зависит от характера повреждений генов-мутаторов.
Мутаторный фенотип у микроорганизмов проявляется в повышенной частоте возникновения спонтанных мутаций, которые можно измерить по частоте появления клеток, выживающих в селективных условиях, например в присутствии антибиотиков. У эукариот мутаторный фенотип часто сопровождается дестабилизацией генома, обнаруживаемой по возрастанию частоты внутригеномных перестроек ДНК. В связи с этим явлением наиболее интенсивно исследуются изменения структуры микросателлитных повторов в геноме человека при онкологических заболеваниях. Сравнение структуры отдельных микросателлитных локусов в клетках опухолей и нормальных тканей одного индивидуума часто обнаруживает существенные различия между микросателлитами одного и того же локуса. Такого рода исследования чаще всего проводятся с помощью ПЦР или любого другого метода, используемого при ДНК-типировании (см. главу 10).
Рис. I.54. Примеры нестабильности микросателлитов (а, на примере карциномы молочной железы) и потери гетерозиготности (б, на примере глиомы) при различных онкологических заболеваниях. Показаны продукты ПЦР после разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
Н – нормальная ткань, О – опухоль. Стрелки указывают на измененные аллели
Наиболее просто обнаруживаются два типа изменений микросателлитов при мутаторном фенотипе (рис. I.54). При одном из них изменение суммарной длины микросателлитных повторов конкретного генетического локуса обнаруживают по возрастанию или уменьшению электрофоретической подвижности соответствующих продуктов ПЦР при сравнении его состояния в опухолевых и нормальных тканях одного и того же организма (см. рис. I.54,а). В исследованиях подобного рода часто наблюдают эффект так называемой потери гетерозиготности исследуемых микросателлитных локусов. Ввиду диплоидности генома человека каждый микросателлитный локус в нем представлен двумя копиями и, следовательно, двумя аллелями в случае его гетерозиготности. При ее потере происходит выравнивание длины обоих микросателлитных аллелей, которые различаются в нормальных тканях, или удаление одного из аллелей в результате делеции. Удаление фиксируют электрофоретически по исчезновению одного из продуктов ПЦР после амплификации соответствующих локусов, не сопровождаемому появлением новых полос (см. рис. I.54,б).
Дестабилизация микросателлитных локусов в опухолевых клетках, по-видимому, не служит непосредственной причиной малигнизации этих клеток. Нестабильность микросателлитов скорее может быть чувствительным маркером мутаторного фенотипа раковых клеток, внешним проявлением дестабилизации генома, характерного для опухолевых клеток многих типов. Варьирование размеров микросателлитных локусов является частным случаем большой группы мутаций, связанных с изменением числа копий последовательностей нуклеотидов в геноме эукариот. В качестве еще одного примера мутаций этого рода рассмотрим изменения размеров небольших кластеров ди- и тринуклеотидных повторов в геномной ДНК. Недавно было установлено, что такие мутации, получившие название экспансии ДНК, лежат в основе многих тяжелых заболеваний человека.