- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
Топоизомеразы контролируют в клетках уровень суперскрученности ДНК, который может изменяться в процессе ее репликации, транскрипции, гомологичной рекомбинации, а также во время перестроек хроматина. Все эти ферменты релаксируют суперскрученные молекулы ДНК, снимая их внутреннее напряжение путем внесения одно- или двухцепочечных разрывов с последующим их восстановлением (лигированием). По механизму действия различают ДНК-топоизомеразы типа I и II. ДНК-топоизомеразы I, которые являются мономерными белками,
Рис. I.3. Основные этапы каталитического цикла топоизомеразы II
Внизу изображен механизм переноса нити ДНК через двухцепочечный разрыв. Точками отмечены места ковалентного присоединения фермента к 5'-концам ДНК в двухцепочечных разрывах. VM26, mAMSA, антрациклины – ингибиторы топоизомеразы II, фиксирующие ковалентный комплекс фермент-ДНК и предотвращающие лигирование двухцепочечного разрыва; L – число зацеплений ДНК в суперскрученной молекуле.
релаксируют ДНК без затраты энергии путем внесения одноцепочечных разрывов. В отличие от этого, ДНК-топоизомеразы II функционируют в виде димеров, осуществляя ATP-зависимое расщепление обеих цепей ДНК с последующим переносом цепей через разрыв и его лигированием (рис. I.3).
Для внесения одноцепочечного разрыва в ДНК все ДНК-топоизомеразы используют остаток Tyr, который осуществляет нуклеофильную атаку фосфатной группы ДНК с образованием фосфотирозина. В результате ферменты оказываются ковалентно связанными с 5'- или 3'-концами ДНК в одноцепочечном разрыве. Образование такой ковалентной связи исключает необходимость затраты энергии при восстановлении фосфодиэфирной связи в одноцепочечном разрыве на заключительных стадиях реакции. У ДНК-топоизомераз типа I имеется один каталитический остаток Tyr на молекулу мономерного белка, тогда как димеры ДНК-топоизомераз II содержат по одному каталитическому остатку на каждую субъединицу, что обеспечивает создание ступенчатого двухцепочечного разрыва в молекуле релаксируемой ДНК.
Обнаружены, по крайней мере, два подтипа ДНК-топоизомераз I – IA и IB, которые, будучи неродственными ферментами как по первичной, так и по пространственной структурам, выполняют аналогичные функции с помощью различных механизмов. До недавнего времени ДНК-топоизомеразы IA считали исключительно прокариотическими ферментами, однако они были найдены и в клетках эукариот, включая клетки человека, и названы ДНК-топоизомеразами III.
ДНК-топоизомераза IA релаксирует ДНК, содержащие только отрицательные супервитки, работает в присутствии ионов Mg2+ и ковалентно соединяется с 5'-концами ДНК в образующихся врéменных одноцепочечных разрывах. Это сближает ДНК-топоизомеразы IA и II между собой, что было подтверждено также структурными исследованиями. В отличие от этого, ДНК-топоизомеразы IB способны релаксировать ДНК как с положительными, так и отрицательными супервитками, не требуют для своего функционирования ионов металлов и взаимодействует ковалентно с 3'-концами ДНК. ДНК-топоизомеразы IB найдены исключительно в клетках эукариот (за единственным исключением вируса вакцины).
В клетках человека ДНК-топоизомераза IB/III специфически ингибируется камптотецином (camptothecin), который в настоящее время рассматривается в качестве перспективного противоопухолевого препарата. Это соединение взаимодействует преимущественно с ковалентным комплексом топоизомераза I–ДНК, что подавляет реакцию восстановления фосфодиэфирной связи и освобождение фермента из комплекса. В результате происходит быстрое накопление двухцепочечных разрывов ДНК и вступление клеток в апоптоз.
ДНК-топоизомераза II является жизненно важным ферментом любого эукариотического организма. Кроме релаксации суперскрученных молекул ДНК она может осуществлять образование или развязывание узлов, а также образование или разделение катенанов (кольцевых замкнутых ДНК, сцепленных друг с другом). Реакции развязывания узлов и разделения катенанов являются прерогативой именно ДНК-топоизомеразы II и не выполняются ДНК-топоизомеразами I.
У дрожжей ДНК-топоизомераза II требуется для разделения катенанов сестринских хроматид хромосом в анафазе митоза и абсолютно необходима для сегрегации хромосом в мейозе, а также конденсации хроматина в процессе формирования метафазных хромосом. Выяснена важная роль ДНК-топоизомеразы II и в формировании высших уровней структуры хроматина, а именно участие фермента в образовании петель хроматина во время конденсации хромосом.
ДНК-топоизомераза II локализована в ядре и в больших количествах ассоциируется с ДНК как в интерфазных, так и метафазных ядрах. С помощью специфических антител показано, что молекулы фермента располагаются преимущественно вдоль центральной продольной оси обоих плеч хромосом у многих организмов. Такое аксиальное распределение ДНК-топоизомеразы II в хромосомах наблюдали даже после удаления из них большей части гистонов в результате многократных солевых экстракций. Специфическая локализация этого фермента в хромосомах очень показательна в свете обсуждавшихся выше петельно-доменных особенностей организации хроматина в ядрах. Создается впечатление, что ДНК-топоизомераза II находится в виде гомодимера в основании петель, взаимодействуя с MAR/SAR-последовательностями ДНК хроматина. Хотя топоизомераза II не обнаруживает строгой специфичности в отношении расщепляемых последовательностей нуклеотидов, на выбор сайтов большое влияние оказывают структурные компоненты хроматина. Показано, что in vivo существуют два класса сайтов, по которым происходит расщепление ДНК этим ферментом: одни из них локализованы в активно транскрибируемых участках хроматина, гиперчувствительных к действию нуклеаз, а другие – непосредственно в MAR/SAR-последовательностях. Ассоциация ДНК-топоизомеразы II с активно транскрибируемыми участками хроматина указывает на ее возможную важную роль в регуляции экспрессии генов, что и было продемонстрировано в недавних экспериментах. Таким образом, ДНК-топоизомераза II является одним из ключевых ферментов, необходимых для разрешения сложных топологических проблем, возникающих при изменении структуры хроматина в процессах репликации ДНК, транскрипции генов и сегрегации хромосом в митозе и мейозе. Определенные изоформы ( или ) этого фермента, по-видимому, играют важную роль в поддержании динамической структуры хроматина интерфазных и митотических хромосом.
Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют о высокоупорядоченной организации генома у любого, особенно эукариотического, организма. Первым уровнем такой упорядоченности является консервативное линейное распределение генов и других последовательностей нуклеотидов вдоль молекул ДНК хромосом, которое служит важным таксономическим признаком. Другим не менее жизненно важным свойством генома эукариот и, по-видимому, таксономическим признаком является его упорядоченное распределение в объеме интерфазных ядер. Высокоспецифическое пространственное распределение хроматина эукариот в интерфазных ядрах можно рассматривать в качестве второго уровня его упорядоченности. Находясь в деконденсированном состоянии после завершения митоза, интерфазные хромосомы не перемешиваются внутри интерфазных ядер, но занимают вполне определенные микрокомпартменты. Определенные участки хромосом, маркированные специфическими (в частности MAR/SAR) последовательностями, служат для прикрепления ДНК хромосом к компонентам ядерного матрикса и ядерных мембран. Такие контакты необходимы для эффективной реализации генетической информации в процессе экспрессии генов, эффективной конденсации хроматина и разделения хромосом в митозе и мейозе. Кроме того, пространственно организованное распределение генетического материала в интерфазных ядрах обеспечивает дифференциальную защиту от мутаций отдельных генетических локусов и, по-видимому, может контролировать темп и направление эволюционных изменений как отдельных локусов, так и организмов в целом (подробнее см. раздел 5.3). К сожалению, исследование пространственной организации генома в интерфазных ядрах (архитектоники ядра) сопряжено с большими методическими трудностями и сегодня еще только начинается.