- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Возможный смысл парадокса с
У организмов, находящихся на примерно одинаковых ступенях эволюционного развития, часто наблюдаются значительные вариации в размерах геномов (см. главу 1). Например, у некоторых видов рыб, относящихся к разным отрядам и подклассам, размеры геномов заметно различаются. Наименьшие геномы характерны для некоторых неродственных видов костистых рыб. В частности, у малоротой корюшки, меченосца или камбалы размер генома приблизительно в 5 раз меньше генома млекопитающих. В то же время у двоякодышащих рыб (одни из немногих выживших представителей кистеперых рыб, которые морфологически практически не изменились за миллионы лет своего существования) размер генома, по крайней мере, в 35 раз превышает размер генома плацентарных млекопитающих. Ввиду большого морфологического и физиологического сходства этих видов рыб можно предположить, что различия в размерах их геномов, главным образом, определяются относительным содержанием в них избыточных последовательностей нуклеотидов.
Развивая концепцию о стабилизирующем влиянии избыточных последовательностей нуклеотидов ДНК на генетическую информацию, заключенную в геноме многоклеточных организмов, можно предполагать, что различия в размерах геномов у близких видов многоклеточных организмов отражают существенные особенности в функционировании их генетического аппарата и его внутриклеточного окружения. У организмов с высоким содержанием избыточной ДНК могут менее эффективно функционировать ферменты репаративной системы, что, в свою очередь, усиливает (имитирует) экзогенное и эндогенное мутагенные воздействия. Действительно, эффективность функционирования систем эксцизионной репарации, по-видимому, существенно различается даже в клетках разных видов млекопитающих. Кроме того, у таких организмов могло бы быть более высоким внутриядерное содержание эндогенных мутагенов в силу видовых особенностей их метаболизма. В связи с этим весьма вероятно, что гигантский размер геномов двоякодышащих рыб и амфибий отражает одну или несколько таких особенностей функционирования их генетического аппарата и его внутриклеточного окружения. Эволюционное включение в их геном большого количества защитных избыточных последовательностей нуклеотидов могло значительно стабилизировать геном и, по-видимому, позволило этим организмам пройти морфологически неизменными через миллионы лет своего существования. С другой стороны, малый размер генома других видов может сочетаться с более эффективно работающими системами репликации и репарации, а также способствовать ускоренному видообразованию.
Таким образом, повышение точности функционирования систем репликации и репарации ДНК, с одной стороны, и увеличение размера генома за счет включения в него некодирующих последовательностей нуклеотидов, с другой, могут приводить к одному и тому же эволюционному последствию: увеличению информационной стабильности генома. Поэтому размер генома современных эукариот эволюционно оптимизирован в отношении максимально допустимой частоты мутаций, совместимых с жизнеспособностью конкретных биологических видов. Сохранение видоспецифических соотношений между кодирующими и некодирующими последовательностями генома эукариот может быть следствием естественного отбора, отсекающего крайние варианты, у которых или слишком мало, или чрезмерный избыток некодирующих последовательностей.
Эволюционное увеличение размера генома понижает требования таких видов к точности функционирования систем репарации геномной ДНК. В результате снижение давления отбора на эти ферментативные системы могло способствовать накоплению в них мутаций, уменьшающих точность функционирования таких систем. Следовательно, суммарный размер генома эукариотического организма отражает не только потребность организма в определенном количестве генетической информации для обеспечения соответствующего уровня сложности его биологической организации, но и особенности жизнедеятельности организма, связанные с интенсивностью экзогенных и эндогенных мутагенных воздействий.
Подводя итоги вышесказанному, необходимо еще раз отметить, что, по крайней мере, две особенности строения генома эукариот могут оказывать влияние на частоту мутаций, возникающих в нем в процессе репликации под действием экзогенных и эндогенных мутагенов. Во-первых, включение избыточных последовательностей нуклеотидов приводит к глобальной защите всех функционально значимых последовательностей генома от эндогенных и экзогенных мутагенов. Избыточные последовательности нуклеотидов генома эукариот весьма существенно стабилизируют геном, что, возможно, является необходимым и достаточным условием для эволюционного появления многоклеточности. Во-вторых, внутриядерная компартментализация последовательностей нуклеотидов геномной ДНК, при которой происходит специфическая упаковка нитей хроматина в индивидуальных компартментах, занимаемых хромомерами и более крупными блоками последовательностей нуклеотидов, должна также сопровождаться изменением частоты мутаций в конкретных генетических локусах пропорционально локальной внутриядерной концентрации ДНК и пространственному расположению отдельных генетических локусов друг относительно друга.
Эволюционно сложившиеся отношения между суммарными длинами экзонов и интронов в индивидуальных генах, а также уровни упаковки и пространственное расположение ДНК в отдельных генетических локусах могли бы указывать на тот максимально допустимый темп мутационных изменений экзонов, который совместим с жизнеспособностью организмов в онтогенезе. С другой стороны, эти соотношения были бы своеобразной генетической программой, предопределяющей и филогенетическое развитие видов. Действительно, селективная видоспецифическая защита отдельных генетических локусов от спонтанного и индуцированного мутагенеза должна сопровождаться преимущественным образованием мутаций в локусах, наименее защищенных некодирующими последовательностями нуклеотидов, на фоне которых и разворачиваются основные события, связанные с естественным отбором. При этом уровни защищенности отдельных генетических локусов определяют различные темпы изменений этих локусов в филогенезе разных таксономических групп организмов. Частоты спонтанных мутаций в индивидуальных генах ограничиваются достаточно узкими рамками, определяемыми пространственной структурой как самих генов, так и более протяженных генетических локусов, включающих в себя некодирующие последовательности нуклеотидов. Такие ограничения могут быть преодолены при более мощных мутагенных воздействиях, однако соотношение частот мутаций, возникающих в разных частях генов, в основном, должно сохраняться, в том числе из-за разной доступности этих частей химическим мутагенам.
Все вышеперечисленные причины могут в конечном счете определять дискретный популяционный полиморфизм и направление изменчивости фенотипов индивидуальных биологических видов, наблюдаемые в природе. В этих терминах можно было бы объяснить закон гомологических рядов Н.И. Вавилова, в соответствии с которым у родственных видов, родов и даже семейств организмов наблюдаются сходные ряды фенотипической изменчивости. Действительно, данное явление вполне естественно объясняется общностью генотипов таких таксономических групп и общностью пространственной структуры их геномов, определяющей мутабильность отдельных генетических локусов и направление эволюционных преобразований этих генов и признаков. Такая генетически детерминированная изменчивость генотипов индивидуальных биологических видов и может дать гомологические ряды фенотипических признаков родственных организмов, которые формируются направленно изменяющимися генотипами. В то же время для образования признаков, выводящих организмы из их таксономических групп, требуются более радикальные преобразования генотипов, чем точковые мутации, которые бы открывали новые участки генома для интенсивного спонтанного мутагенеза. Направленная изменчивость генотипов, определяемая пространственной структурой и составом интерфазных хромосом, должна допускать в больших популяциях одновременное образование одних и тех же мутантных фенотипических признаков у большого числа особей и ускорять процесс видообразования.
Не исключено, что еще большее, чем интроны, отношение к генетической программе филогенетического развития имеют крупные блоки повторяющихся последовательностей индивидуальных хромосом, которые окружают и в разной степени защищают от мутационных изменений участки генома, наиболее важные для видообразования и сохранения вида как такового. Анализ и картирование этих блоков в геноме многоклеточных организмов могут способствовать выявлению новых функционально значимых участков генома и их экспериментальному исследованию. Не менее интересные результаты может принести и анализ интрон-экзонной структуры известных генов, а также фланкирующих генов избыточных последовательностей по уровню защищенности индивидуальных генов от мутаций. Такой анализ может по-новому осветить генетическую значимость уже известных участков генома. С использованием аналогичного подхода могут быть выявлены новые жизненно важные гены, которые организм особенно бережно укрывает от мутаций избыточными последовательностями нуклеотидов.
Организовав геном эукариот таким изящным (но не безупречным) образом, природа сама указывает на его слабые места и возможные пути дальнейшего совершенствования. Уязвимость современного генома в отношении неблагоприятных экологических факторов (в первую очередь, антропогенных) может быть связана с тем, что в доисторические времена, когда происходила адаптивная эволюция организмов, экологическая обстановка была существенно благоприятнее. Крупные геномы гораздо более чувствительны как мишени для ионизирующих излучений, а этот фактор в те времена мог не иметь большого значения, и эволюционирующим организмам не нужно было к нему приспосабливаться. Уязвимость такого сложноорганизованного генома, как геном эукариот, заключается еще и в том, что его мутационные изменения, нарушающие пространственную организацию укладки ДНК в интерфазных ядрах, могут быть причиной возникновения мутаторного фенотипа мутантных соматических клеток. Этот фенотип, в свою очередь, может вызывать тяжелые патологические изменения организма, включая онкологические, аутоиммунные и другие тяжелые заболевания. С другой стороны, введение генно-инженерными методами генетически нейтральных последовательностей нуклеотидов, изменяющих доступность для мутагенов особенно важных генетических локусов генома, могло бы повысить устойчивость организма к мутагенным воздействиям, тем самым оградив его от многих патологий и увеличив продолжительность жизни. Такой генно-инженерный подход мог бы стать одним из элементов превентивной генотерапии.
С учетом всего сказанного вряд ли можно считать избыточные последовательности нуклеотидов эукариот "эгоистичными" геномными паразитами, как это часто обсуждается в современной литературе. Избыточные последовательности нуклеотидов в геноме, количество и локализация которых, по-видимому, строго сбалансированы по отношению к функционально значимым последовательностям в процессе эволюции, ведут себя вполне "альтруистично", принимая удар мутагенов на себя и специфически защищая жизненно важные участки ДНК от мутаций. Их "самоотверженное" "альтруистичное" поведение способствует сохранению хрупкой стабильности генома эукариот на приемлемом уровне и дает возможность многоклеточным организмам существовать в виде гигантских клонов высококооперированных соматических клеток, а также, вероятно, перспективу и вектор их филогенетического развития.