2. Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)

Клетки миеломы находят широкое применение для получения гибридом – линий клеток, производящих моноклональные антитела определенной специфичности. Поскольку эти клетки осуществляют эффективную секрецию рекомбинантных белков, они хорошо изучены в отношении экспрессии в них соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции. Кроме того, такие клетки способны расти в суспензионной культуре (без прикрепления к поверхности субстрата), что облегчает их культивирование при необходимости крупномасштабной наработки.

Линия клеток мышиной миеломы Sp2/0 Ag14, утративших способность синтезировать или секретировать иммуноглобулины, часто используется для производства рекомбинантных белков. Клетки этой линии легко трансфецируемы рекомбинантными ДНК и могут выращиваться в больших количествах на питательной среде без дорогостоящей сыворотки. Клетки Sp2/0 экспрессируют эндогенный ген ДГФР, что делает невозможным их прямое применение для амплификации рекомбинантных ДНК с использованием метотрексата. Это затруднение обычно преодолевают путем введения в экспрессирующий вектор мутантного гена ДГФР, в котором точковая мутация, сопровождаемая заменой TG, приводит к замещению LeuArg в положении 22 полипептидной цепи ДГФР, следствием чего является понижение сродства фермента к метотрексату в 270 раз. Благодаря этому после трансфекции может быть проведен отбор клеток, содержащих мутантный ген ДГФР вместо нормального, путем постепенного увеличения концентрации метотрексата в среде. При умеренных концентрациях ингибитора эндогенный ген ДГФР полностью инактивируется, тогда как мутантный ген остается активным и может быть амплифицирован в результате описанного выше механизма после повышения концентрации метотрексата в среде. Однако уровень амплификации гена ДГФР и ассоциированного с ним рекомбинантного гена в такой системе как правило ниже, чем в обычной, так как меньшее число внутриклеточных копий мутантного гена требуется для обеспечения необходимого уровня устойчивости клеток к ингибитору. Кроме того, было показано, что высокий уровень внутриклеточной экспрессии рекомбинантных генов, введенных в клетки Sp2/0 с помощью трансфекции, может обеспечиваться после инкубации с метотрексатом за счет увеличения скорости их транскрипции, а не в результате их амплификации. Такой результат может быть получен в результате введения множественных копий гена ДГФР при трансфекции. Структура одного из векторов, пригодного для использования с миеломными клетками Sp2/0, представлена на рис. II.13,б). Транскрипция трансгенов в этом векторе обеспечивается промоторно–энхансерными элементами гена иммуноглобулина с участием эндогенных регуляторных факторов клеток миеломы.

3. Клетки селезенки мышей (линия mel)

Обе системы экспрессии, описанные выше, базируются на амплификации трансгенов, обеспечивающей высокий уровень внутриклеточного синтеза кодируемых ими рекомбинантных белков в отобранных клонах клеток. Тем не менее, в природе уникальные гены (т.е. присутствующие в виде одной копии на гаплоидный геном) могут экспрессироваться с очень высокой эффективностью. Примером этого являются, например иммуноглобулины, секретируемые плазматическими клетками, или глобины, синтезируемые в больших количествах клетками эритроидного ряда. Высокий уровень транскрипции глобинового локуса становится возможным не только благодаря функционированию эффективных промотора и энхансера, но и в результате присутствия так называемой доминантной регуляторной области (dominant control region – DCR), изменяющей пространственную структуру хроматина всего локуса. DCR расположена за ~50 т.п.о. перед кластером глобиновых генов и вначале была идентифицирована благодаря присутствию в ней нескольких сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе. Путем комбинирования последовательностей нуклеотидов, окружающих сайты, удалось сконструировать небольшую искусственную DCR, обладающую всеми основными свойствами исходной. Рекомбинантные гены, объединенные в векторе с такой DCR, экспрессировались с высокой эффективностью в клетках эритроидного ряда независимо от места их интеграции в геном и не требовали для этого предварительной амплификации. Таким образом, рассматриваемая система позволяет избежать отрицательного влияния эффекта положения у рекомбинантных генов, что избавляет от необходимости скрининга большого числа трансфецированных клеток для получения высокопродуктивных продуцентов рекомбинантных белков.

Для биотехнологических целей в настоящее время часто используется линия клеток MEL-E9, которая является производной линии клеток MEL-NP5, полученных из селезенки мышей NFS, зараженных дефектным по репликации вирусом, образующим фокусы селезенки (spleen focus forming virus – SSFV). Эти клетки не образуют вирусных частиц, но вызывают возникновение опухолей после инъекции сингенным мышам. Они не претерпевают спонтанной дифференцировки, однако под действием экзогенных факторов (диметилсульфоксида, гемина или гексаметиленбисацетамида) дифференцируются в клетки, содержащие гемоглобин.

На рис. II.13,в изображена схема экспрессирующего вектора, применяемого с этой линией клеток. В нем область DCR соединена с промотором, экзоном 2, интроном 2 и экзоном 3 -глобинового гена, поскольку показано, что присутствие последовательностей нуклеотидов интрона 2 абсолютно необходимо для эффективной экспрессии генов, направляемой этим промотором. Рекомбинантный ген может быть встроен справа или слева от интрона 2. После успешной трансфекции этот экспрессирующий вектор обеспечивает независимую от эффекта положения и числа копий тканеспецифическую экспрессию рекомбинантных генов в клетках эритроидного ряда.