- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Свойства рибозимов
Стабильность рибозимов в биологических жидкостях. Нестабильность РНК является одним из основных ограничений, препятствующих эффективному их использованию in vivo в качестве лекарственных средств. Поскольку рибозимы представляют собой короткие молекулы, которые можно получать в результате химического синтеза, химические модификации этих олигонуклеотидов рассматриваются как одна из перспективных возможностей повышения их устойчивости к нуклеазам. Было установлено, что введение 2’-O-Me-модифицированных нуклеотидов вместо обычных во все, кроме пяти, положения HH-рибозима позволило повысить его стабильность, по крайней мере, в 1000 раз без существенной потери каталитической активности. Другие модификации нуклеотидов в определенных положениях: введение 2'-О-аллильных групп, фосфоротиоатных связей вместо фосфодиэфирных, замена пиримидинов их 2’-амино- или 2’-фторпроизводными, использование различных 2’-производных сахаров в сахарофосфатном остове РНК и т.п., как правило, приводили к снижению активности рибозимов, но сопровождались повышением их стабильности. Улучшенные конструкции рибозимов с модифицированными сахарами обладали каталитической активностью, свойственной рибозимам дикого типа, со временем полужизни в сыворотке крови человека 5–8 ч. Кроме того, введение на 3’-конец рибозима остатка dT, соединенного связью 3’-3’, сопровождалось увеличением времени его полужизни в сыворотке до 3 дней.
Адресная доставка искусственных рибозимов. Существуют два основных подхода к адресной доставке олигонуклеотидов. При одном из них синтезированные молекулы рибозимов объединяют химическими методами или физически с макромолекулами, например липидами или лигандами рецепторов. В зависимости от природы молекул, находящихся в комплексе с рибозимом, его доставка будет либо неспецифической (в составе липосом), либо более специфической, которая может обеспечиваться, например эндоцитозом, опосредованным рецепторами. Другая группа методов использует экспрессирующие векторы, содержащие ген рибозима, транскрипция которого сопровождается внутриклеточным биосинтезом его молекул.
В ходе исследований по оптимизации адресной доставки рибозимов были изучены многие конструкции липидных носителей. Такие конструкции позволяют инкапсулировать большое количество молекул рибозимов как в водном окружении, так и растворенными в липидном бислое. Соединение липосом с молекулами соответствующих антител или других лигандов может до некоторой (хотя и небольшой) степени обеспечивать тканеспецифическую доставку рибозимов и их проникновение в клетки требуемых типов, например пораженных вирусами. Циркулирующие липосомы быстро удаляются из кровотока макрофагами ретикулоэндотелиальной системы. Химическая модификация липидного бислоя или покрытие липосом оболочкой из полиэтиленгликоля ослабляют неспецифическую сорбцию белков сыворотки, а следовательно, и неспецифическое распознавание липосом макрофагами.
Для создания альтернативных гидрофобных комплексов молекул рибозимов с носителем иногда используют катионные липиды. Такие липиды содержат длинные цепи жирных кислот (обычно C16 или C18), соединенные с полиамином. Полагают, что комплексы катионных липидов с олигонуклеотидами не образуют липосомоподобных структур. Результаты, полученные при исследовании возможностей адресной доставки рибозимов с помощью липосом и другими аналогичными методами, вселяют оптимизм. Однако до сих пор эти методы остаются чисто эмпирическими и должны разрабатываться индивидуально для каждого нового рибозима и типа клеток, в которые предполагается его доставлять.
Для адресной доставки генов рибозимов в составе экспрессирующих векторов используют те же приемы, что и при генотерапии (подробнее см. раздел 10.4). Особенно часто для этой цели применяются ретровирусы. Включение в состав рибозима сигнальной последовательности этих вирусов, обеспечивающей упаковку их РНК в вирусные частицы, на 90% снижает титр соответствующих ретровирусов. При этом рибозим не оказывал влияния на те же мишени, локализованные в цитоплазме.
Аденоассоциированные вирусы (ААВ), способные доставлять свою ДНК в клетки многих типов, также часто используются в качестве носителей для векторов, экспрессирующих рибозимы. Недавно сконструирован вектор, который из всех последовательностей ААВ содержал только концевые последовательности. С использованием этого вектора получена экспрессия антисмысловых РНК гена tar вируса иммунодефицита человека, которая блокировала его размножение. С помощью аденовирусов можно не только направленно осуществлять доставку экспрессирующихся генов, но и переносить большие молекулы декстранов, белков и плазмид, связанных с лигандами, способными и неспособными к независимой репликации. Например, удается транспортировать гены к дыхательному эпителию в составе комплексов аденовирус–полилизин–ДНК. Адресная доставка векторов к требуемым клеткам или тканям может быть осуществлена также непосредственно в виде аэрозоля (эпителий легких) или ex vivo в случае клеток костного мозга, который далее повторно вводят в организм больного.
Исследование функционирования рибозимов in vivo. Для доказательства возможности использования рибозимов как лекарственных средств необходимо было прежде всего продемонстрировать, что осуществляемое ими расщепление мРНК сопровождается ожидаемыми физиологическими и биохимическими изменениями в организме. В одних из первых опытов использовали рибозимы, направленные против мРНК хлорамфениколацетилтрансферазы (ХАТ), ген которой экспрессировался в клетках животных. Рибозимы, синтез которых обеспечивался экспрессирующими векторами, специфически на 60% подавляли внутриклеточный синтез ХАТ. Кроме того, было показано направленное действие рибозимов против 28S рРНК и ее предшественников, а также мРНК -лактальбумина, но не других родственных РНК, находящихся в клетках. В результате в настоящее время считается признанным, что принцип действия рибозимов подтвержден на клеточном уровне.
Для доказательства эффективности действия рибозимов in vivo с помощью этих агентов была предпринята попытка индуцировать диабет у мышей путем воздействия на мРНК глюкокиназы -клеток поджелудочной железы с помощью специфически экспрессирующегося в них трансгена рибозима. Оказалось, что у экспериментальных мышей активность глюкокиназы снижена в три раза именно в -клетках, что приводило к нарушению секреции ими инсулина и ответа на глюкозу. При этом рибозим не оказывал влияния на функционирование клеток печени. Тем не менее уровень глюкозы в крови таких трансгенных мышей оставался прежним, что позволило сделать вывод о важности дефицита по глюкокиназе печени, а не только поджелудочной железы для развития симптомов заболевания. Эти опыты продемонстрировали возможность использования рибозимов для исследования физиологии у интактных животных.
Эффектные результаты с рибозимами удалось получить и на дрозофиле. Были созданы трансгенные яйца мух, содержащие ген рибозима, действующего на мРНК гена fushi tarazu (ftz), находящегося под контролем температурно-чувствительного промотора. Этот гомеозисный ген уже упоминался в связи с обсуждением регулирующих его экспрессию факторов транскрипции в первой части книги. Индуцируя рибозим в определенные фазы эмбрионального развития дрозофилы, установили, что вначале нарушение функционирования гена ftz приводит к нарушению сегментации кутикулы у личинок. Если ген инактивировали во время нейрогенеза, то нарушалось развитие центральной нервной системы на фоне нормального развития кутикулы. Эти опыты показали, что индукция рибозима у дрозофилы фенотипически проявляется точно так же, как мутации, инактивирующие ген ftz, и не сопровождается другими видимыми нарушениями в организме.
Введение в мужские пронуклеусы оплодотворенных ооцитов мышей плазмиды, экспрессирующей рибозим, направленный против мРНК 2-макроглобулина, сопровождалось его последующим синтезом в легких, почках и селезенке взрослых животных. При этом в легких происходило снижение уровня мРНК 2-макроглобулина более чем на 90%. Не столь значительное уменьшение содержания мРНК наблюдали в почках и селезенке.
Первые опыты с рибозимами, включенными в состав антисмысловых РНК, показали их высокую эффективность и специфичность in vitro и меньшую эффективность in vivo. Это может быть связано с тем, что РНК в эукариотических клетках, как правило, находится в составе больших рибонуклеопротеидных комплексов и может быть труднодоступной для антисмысловых РНК, в связи с чем потребуется разработка дополнительных условий для повышения эффективности рибозимов, включенных в состав антисмысловых РНК.