- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Sos-мутагенез у бактерий
Образование мутаций в клетках организма, подвергнутого мутагенному воздействию, происходит в основном по одному и тому же механизму. При прохождении репликативного комплекса через некодирующий или ошибочно кодирующий поврежденный участок ДНК наблюдается включение в синтезируемую цепь случайных или соответствующих мутантному участку нуклеотидов. Затем репликация ДНК продолжается в обычном режиме. Таким образом, природа первичных повреждений матричной ДНК определяет тип мутационных замен нуклеотидов в ДНК.
У E. coli мутагенез под действием УФ-света и многих химических веществ происходит в результате координированной экспрессии большого числа генов, индуцируемых в ответ на повреждение ДНК. Такая реакция бактериальных клеток на генотоксические воздействия получила название SOS-ответа, а сам процесс образования мутаций – SOS-мутагенеза. В индукции SOS-ответа у E. coli определяющую роль играют два гена: lexA и recA. Белок LexA является репрессором гена recA и более 20 других генов и оперонов, составляющих SOS-регулон. В ответ на повреждение ДНК или ингибирование репликации, как правило, при прохождении ДНК-полимеразой поврежденного участка ДНК вырабатывается внутриклеточный SOS-сигнал. При этом продукт гена recA связывается с одноцепочечными участками ДНК и в результате конформационного перехода обратимо превращается в активированную форму RecA*. Молекулы белка LexA диффундируют к RecA* и взаимодействуют с ним, что сопровождается протеолитическим расщеплением LexA вблизи середины его полипептидной цепи (связь Ala-84Gly-85), что инактивирует LexA как репрессор. В результате происходит индукция LexA-зависимых генов SOS-регулона. В этой реакции белок RecA* не действует как протеиназа, но активирует криптическую протеиназную активность LexA, что завершается расщеплением полипептидной цепи репрессора по аутокаталитическому механизму.
Исследование мутантов E. coli, неспособных к SOS-ответу при УФ-повреждениях, привело к открытию еще одного ключевого локуса umuC. Оказалось, что этот локус является опероном, состоящим из двух генов – umuD и umuC. Потеря функции любого из данных генов приводит к подавлению SOS-ответа мутантных бактерий. Таким образом, umuCD-оперон, находящийся под контролем репрессора LexA, входит в состав SOS-регулона, и его функционирование абсолютно необходимо для SOS-мутагенеза. Во время SOS-ответа белок UmuD также расщепляется по аутокаталитическому механизму, запускаемому RecA*. Образующийся в результате полипептид UmuD’ с молекулярной массой 12 кДа, включающий С-концевые остатки UmuD, оказался одним из самых важных компонентов системы SOS-ответа и SOS-мутагенеза у E. coli. Исследования различных мутантных производных UmuD показали, что его нативная форма не является просто неактивным предшественником белка UmuD’, а выполняет функции репрессора SOS-ответа. В растворе UmuD и UmuD’ существуют как в виде гомодимеров, так и более стабильного гетеродимера UmuD–UmuD’, каждый из которых может объединяться с белком UmuС. Комплекс (UmuD’)2–UmuC запускает SOS-ответ, тогда как тримеры (UmuD)2–UmuC и UmuD–UmuD’–UmuC являются в этом отношении неактивными. Образование последнего гетеротримерного комплекса играет важную роль в прекращении клеткой SOS-ответа, так как в этом случае активные внутриклеточные UmuD’ и UmuC выводятся из реакции.
Белок RecA, кроме двух вышеупомянутых функций в индукции аутокаталитического расщепления LexA и UmuD, выполняет и третью функцию в SOS-ответе: участвует в формировании так называемых нуклеиново-белковых филаментов в местах одноцепочечных брешей на поврежденной ДНК. С этими филаментами могут соединяться белки UmuD’ и UmuC в составе активного комплекса. Предполагают, что в результате такого взаимодействия комплекс (UmuD’)2–UmuC осуществляет переключение репаративного синтеза ДНК с нужд гомологичной рекомбинации на SOS-мутагенез. Среди других белковых компонентов системы SOS-мутагенеза E. coli необходимо отметить холофермент ДНК-полимеразы III, который проводит включение нуклеотидов в строящуюся цепь ДНК на поврежденном участке. Кроме того, для нормального функционирования системы SOS-мутагенеза необходимы продукты генов groEL и groES, являющиеся молекулярными шаперонами. Их роль, как полагают, сводится к стабилизации и обеспечению правильного фолдинга белка UmuC.
Таким образом, синтез ДНК на поврежденном участке требует наличия белков UmuD’, UmuC, RecA и холофермента ДНК-полимеразы III. Это было окончательно подтверждено при использовании бесклеточной системы, содержащей все вышеупомянутые белки, а также фрагмент одноцепочечной ДНК с единственным мутантным сайтом без одного азотистого основания. Способность ДНК-полимеразы III преодолевать поврежденный участок ДНК в отсутствие UmuD’, UmuC или RecA была оценена в 0,5%, однако при наличии всех компонентов в реакционной смеси эффективность преодоления поврежденного участка увеличивалась в 10 раз. Очищенная ДНК-полимераза I не заменяет ДНК-полимеразу III в этих опытах. Настоящая роль белкового комплекса (UmuD’)2–UmuC в данном процессе неизвестна. Предполагают, что комплекс может изменять процессивность ДНК-полимеразы, подавлять ее корректирующую 3’→5’-экзонуклеазную активность или изменять конформацию фермента на такую, при которой она начинает неадекватно оценивать пространственную структуру комплекса, образующегося с участием Уотсон–Криковских водородных связей между нуклеотидом матрицы и очередным входящим нуклеотидом. Любое из этих изменений должно сопровождаться повышением частоты ошибочного включения нуклеотидов. Недавно (1998 г.) было установлено, что тример (UmuD’)2–UmuC сам по себе обладает слабой ДНК-полимеразной активностью и, возможно, именно этот комплекс осуществляет синтез ДНК непосредственно в поврежденном участке в присутствии всех вышеупомянутых компонентов. В этой связи тример получил название ДНК-полимеразы V Е. coli.
Белок Rev1 дрожжей, гомологичный белку UmuC E. coli, в очищенном состоянии обладает способностью неспецифически включать остатки dCMP в строящуюся цепь ДНК на участке матрицы, в котором отсутствуют азотистые основания. На этом основании он был отнесен к ДНК-полимеразам и был назван дезоксицитидилтрансферазой.
Уникальными свойствами обладает новая ДНК-полимераза IV E. coli, кодируемая геном dinB, которая также участвует в SOS-ответе бактерий. Очищенная до состояния, близкого к гомогенному (1999 г.), она не обладает 3'→5'-экзонуклеазной активностью и способна включать нуклеотиды в строящуюся цепь ДНК по высокодистрибутивному механизму. При каждом контакте фермента с субстратом и гибридом праймер–матрица к праймеру присоединяется единственный нуклеотид. В том случае, если вблизи 3'-конца праймера присутствует ошибочно спаренный нуклеотид (особенно пара G–G), то ДНК-полимераза IV в процессе синтеза ДНК осуществляет сдвиг рамки считывания в результате делеции одного нуклеотида. Такой механизм может потенциально исправить мутагенные последствия смещения 3'-конца праймера по отношению к правильной рамке считывания в поврежденной ДНК-матрице. Полагают, что если во время репликации участков ДНК с простыми повторяющимися последовательностями в результате их повреждения происходит включение неправильно спаренного нуклеотида с последующим проскальзыванием 3'-конца строящейся цепи ДНК и образованием мутации со сдвигом рамки считывания, то происходит задержка репликативного комплекса и его диссоциация. В этих условиях синтез ДНК может быть продолжен ДНК-полимеразой IV, которая путем внесения дополнительных мутаций может исправить первоначальный сдвиг рамки.
Таким образом, SOS-мутагенез дает возможность микроорганизмам преодолевать летальное действие повреждений ДНК, что особенно важно при нарушениях ее структуры, которые блокируют репликацию ДНК и с которыми не справляется обычная репаративная система. В этом смысле наиболее опасны одноцепочечные бреши, в которых сохранившаяся цепь не содержит азотистых оснований. При таком развитии событий SOS-мутагенез является вторичным процессом – следствием заполнения бреши случайными нуклеотидами. Однако при некоторых видах повреждений во время SOS-ответа в растущую цепь ДНК включаются нуклеотиды, восстанавливающие ее исходную первичную структуру, т.е. происходит истинная репарация повреждений. В этой связи второй функцией SOS-мутагенеза может быть предоставление микроорганизму возможности противостоять определенным генотоксическим воздействиям окружающей среды, а именно таким классам химических мутагенов, последствия действия которых не преодолеваются системами эксцизионной или иной репарации, функционирующими с высокой точностью. Система SOS-мутагенеза, по-видимому, обеспечивает протекание последовательности реакций, обозначаемых как "повторный старт репликации", что имеет место после временной (на 30–45 мин) задержки синтеза ДНК в ответ на ее повреждения генотоксическими агентами. Не исключено также, что SOS-мутагенез создает бактериальным клеткам определенные эволюционные преимущества, так как способствует поддержанию генетического разнообразия в популяциях этих микроорганизмов.