- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Подходы к созданию новых ферментов
Подавляющее большинство исследований, в которых методы белковой инженерии используют для замен отдельных аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков, заканчиваются получением мутантных производных, у которых отсутствует, резко ослаблена или остается неизменной исходная ферментативная активность. В таких опытах обычно локализуют отдельные остатки аминокислот, участвующих в формировании активных центров ферментов. Однако в ряде случаев методами направленного мутагенеза удается целенаправленно и кардинально изменять свойства белков. В опытах такого рода можно повысить термостабильность исследуемых белков, усилить их устойчивость по отношению к окислению, протеолизу и другим неблагоприятным воздействиям, а также изменить у исходных ферментов субстратную специфичность.
Серия работ была проведена на субтилизине – протеолитическом ферменте бактерий рода Bacillus. В активном центре субтилизина B. lentus в положении 222 находится метионин. Окисление Met-222 сопровождается образованием соответствующего сульфоксида и полностью инактивирует фермент. Методом направленного мутагенеза произвели замену Met-222Cys и остатки цистеина модифицировали тиоалкилирующим агентом. Это делало фермент высокоустойчивым к окислению и сопровождалось лишь незначительной потерей его активности. Новые свойства модифицированного субтилизина расширяют возможности его применения в биотехнологии. Путем замены отдельных аминокислотных остатков субтилизина в других работах удавалось изменять его субстратную специфичность, повышать удельную активность, изменять оптимум pH и увеличивать устойчивость по отношению к щелочи.
Эти работы иллюстрируют возможности данного направления исследований в белковой инженерии, направленных на создание высокотехнологичных ферментов, способных длительное время функционировать в жестких условиях ферментации на промышленных установках. На еще одно направление развития исследований в белковой инженерии указывают работы по направленному изменению субстратной специфичности ферментов путем замены отдельных аминокислотных остатков в их полипептидных цепях. Например, замена Met-73 у ингибитора субтилизина Streptomyces lividans на Lys или Arg приводила к появлению у него способности ингибировать трипсин. При этом у мутантного ингибитора с заменой Met-73Lys появлялась также способность ингибировать лизилэндопептидазу, а ингибитор с заменой Met-73 на Tyr или Trp подавлял активность -трипсиногена. Исследования продемонстрировали функциональную значимость остатка Met-73 в так называемом PI-сайте участка полипептидной цепи, контактирующего с ингибируемыми ферментами, и позволили создать модель такого белок-белкового взаимодействия. Кроме того, эти работы являются основой для конструирования новых ингибиторов сериновых протеиназ, а также более глубокого изучения механизма их ингибирующего действия.
Такой же подход с целенаправленными заменами отдельных аминокислотных остатков был использован для изменения субстратной специфичности трипсина. В этом случае предварительный теоретический анализ структурных особенностей активного центра трипсина и особенно его субстрат-связывающего участка позволил предсказать аминокислотные остатки, существенные для взаимодействия субстрата с ферментом и обеспечивающие специфичность его действия. Проведенная на основании такого анализа замена Gly-226 на Ala резко (в 100 раз) уменьшила способность мутантного трипсина гидролизовать субстраты, содержащие Arg, и в значительно меньшей степени повлияла на его активность в отношении лизиновых субстратов. Обратную, хотя и менее ярко выраженную, картину наблюдали при замене Gly-216 Ala. Проведенная группой И. Сигала замена Ser-70 в активном центре -лактамазы на Cys также изменяла ее субстратную специфичность. Константа связывания субстрата – пенициллина – мутантным ферментом оставалась неизменной, тогда как скорость его расщепления уменьшалась в 50–100 раз. В то же время мутантная -лактамаза была более активна, чем фермент дикого типа по отношению к цефалоспоринам – аналогам пенициллина, так называемым антибиотикам третьего поколения. Возможность изменения субстратной специфичности путем замены отдельных аминокислот была продемонстрирована недавно и для цитохромов группы P-450. Мышиные цитохромы P-45015 и P-450coh экспрессируются в клетках печени самок и почек самцов соответственно. Первый из них катализирует 15-гидроксилирование 4-3-кетостероидов типа тестостерона, тогда как второй – гидроксилирование кумарина в положении 7. Несмотря на свою разную субстратную специфичность оба фермента различаются лишь по 11 (из 494) аминокислотным остаткам. Осуществляя последовательные замены этих 11 аминокислот, установили, что замена единственной аминокислоты Phe-209Leu в полипептидной цепи цитохрома P-450coh приводит к появлению у него способности гидроксилировать стероиды, т.е. активности цитохрома P-45015, и к потере способности использовать кумарин в качестве субстрата.
Эти далеко не исчерпывающие примеры демонстрируют возможности одного из двух основных подходов к созданию методами белковой инженерии белков с новыми каталитическими активностями. Такой подход заключается в изменении существующих активных центров ферментов путем замен отдельных аминокислотных остатков, которые участвуют в формировании активных центров. Принципиально другой подход к получению ферментов новой специфичности заключается в модификации методами белковой инженерии биологических рецепторов путем введения каталитических функциональных групп в центры связывания лигандов-субстратов. Такой подход был, в частности, реализован при конструировании методом направленного мутагенеза каталитических антител – абзимов.
Была поставлена задача методами белковой инженерии на основе иммуноглобулинов, специфически взаимодействующих с динитрофенильными группами антигенов, получить абзимы, гидролизующие эфиры динитрофенола следующей структуры:
Исходя из того, что имидазол действует в качестве нуклеофильного катализатора при гидролизе карбоксиэфиров в водных растворах, предполагали, что введение остатка гистидина в центр связывания динитрофенильных лигандов иммуноглобулина может придать ему способность осуществлять гидролиз сложных эфиров динитрофенола. В качестве исходного белка при конструировании абзима использовали VL- и VH-фрагменты тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, специфически взаимодействующего с динитрофенильными группами антигенов. VL- и VH-фрагменты представляют собой вариабельные области иммуноглобулина, которые взаимодействуют с антигеном. Фрагмент ДНК, кодирующий VL-область легкой цепи, синтезировали in vitro и экспрессировали в клетках E. coli. При этом в процессе синтеза кодон, кодирующий Tyr-34, был изменен на кодон His, так как было известно, что именно Tyr-34 контактирует с молекулами динитрофенола в комплексах антиген–антитело. Очищенный рекомбинантный VL-фрагмент объединяли с VH-фрагментом тяжелой цепи природного иммуноглобулина, взаимодействующего с динитрофенолом, что приводило к образованию так называемого Fv-фрагмента.
Оказалось, что такой мутантный Fv-фрагмент способен катализировать гидролиз кумаринового эфира 5-(2,4-динитрофенил)аминопентаноевой кислоты (см. выше структурную формулу, n=4) в 90 000 раз более эффективно, чем 4-метилимидазол, и начальная скорость гидролиза была в 45 раз выше, чем у Fv-фрагмента дикого типа. При этом мутантный Fv-фрагмент был неактивен в отношении аминопропаноевого (n=2) и аминогексаноевого (n=5) аналогов субстрата. Таким образом, с помощью замены единственной аминокислоты в антигенсвязывающем центре иммуноглобулина удалось создать на его основе высокоспецифичный гидролитический фермент, а сам процесс его конструирования был основан на знании молекулярных механизмов катализа и взаимодействия антигенов с антителами.
В настоящее время реализованы оба подхода к созданию искусственных ферментов с новыми субстратными специфичностями, основанные на изменении отдельных аминокислотных остатков в субстрат- или лигандсвязывающих центрах ферментов или рецепторов. По мере углубления знаний о механизмах действия ферментов и закономерностей реализации потенций первичной структуры полипептидных цепей в их пространственной структуре появится возможность конструирования абсолютно новых белков с заданной ферментативной активностью. С этого момента значительно расширится поле деятельности белковой инженерии, которая вместе с генной инженерией сможет решать задачи, связанные с целенаправленным изменением уже известных и созданием новых метаболических путей в клетках живых организмов.