- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Днк-диагностика и днк-типирование
Рис. II.30. Генетические последствия мутаций, происходящих в геноме соматических клеток человека на разных стадиях эмбриогенеза
Черным цветом закрашены места локализации клонов мутантных клеток разных размеров в организме человека
Исследования показывают, что большинство заболеваний человека, а возможно, и все его болезни связаны с мутациями, приводящими к изменению уровней экспрессии конкретных генов. Мутации в определенных генах нарушают функционирование биохимических систем, что в конце концов приводит к развитию соответствующих патологических состояний организма (рис. II.30). В том случае, если мутации происходят в геноме клеток зародышевой линии человека, все соматические клетки организма-потомка, который развивается из мутантной зиготы, образовавшейся от слияния мутантных гамет в процессе оплодотворения, будут содержать указанную мутацию. Чем позже в онтогенезе человека возникает соматическая мутация, тем меньше размер клона мутантных клеток во взрослом организме. Если же мутация доминантна, т.е. патологический мутантный признак, определяемый мутантным геном, проявляется даже при наличии в соматических клетках копии нормального гена, полученного от другого родителя, то возникает наследственное заболевание.
В случаях, когда мутация, определяющая мутантный фенотип, рецессивна (ее действие проявляется лишь в гомозиготном состоянии, при котором один и тот же мутантный ген получен от каждого из родителей), можно говорить о предрасположенности организма-гетерозиготы к соответствующему заболеванию и носительстве мутантного гена. Действительно, организм, у которого действие рецессивной мутации маскируется функционированием другого, полноценного аллеля, внешне (фенотипически) выглядит нормальным. Однако у такого организма гораздо больше шансов дать больное потомство в браке с носителем такого же мутантного гена, что является одной из причин запрета на близкородственные браки. С другой стороны, у носителей мутантных генов в гетерозиготном состоянии может произойти соматическая мутация в соответствующем аллельном гене соматических клеток, что также станет причиной развития приобретенного генетического заболевания. В качестве одного из примеров такого заболевания мы уже рассматривали ранее ретинобластому – онкологическое заболевание, поражающее сетчатку глаз, чаще всего, в детском возрасте. Это заболевание развивается в два этапа: вначале организм ребенка получает от одного из родителей мутантный ген RB1, являющийся рецессивным онкогеном (антионкогеном), а затем в онтогенезе в одной из соматических клеток в результате мутации происходит инактивация второй его копии, что вызывает малигнизацию клетки и развитие опухоли. Такой же механизм лежит в основе возникновения некоторых форм диабета, а также ряда онкологических и аутоиммунных заболеваний.
Традиционная диагностика наследственных и инфекционных заболеваний строится на детальном изучении симптомов и проведении многочисленных биохимических анализов, включая культивирование патогенных микроорганизмов на сложных питательных средах. При этом выявление бессимптомного носительства вредных аллелей и микроорганизмов-возбудителей превращается в чрезвычайно трудоемкую задачу. В частности, традиционными цитогенетическими методами можно выявить в геноме человека лишь некоторые крупные хромосомные перестройки: протяженные делеции и транслокации генетического материала, потерю или приобретение целых хромосом. При этом мелкие делеции, транслокации и вставки, а также точковые мутации, которые являются наиболее часто встречающимися изменениями генетического материала, остаются не обнаруженными. То же имеет место и при диагностике бессимптомного носительства возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, например вируса иммунодефицита человека, которые в латентной стадии инфекции могут присутствовать в организме человека лишь в небольшом числе копий.
Разработанные недавно новые методы молекулярной биологии, и особенно метод ПЦР, значительно облегчили проведение диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. При этом мутации выявляются в ДНК клинических образцов, а бессимптомное присутствие возбудителей обнаруживают по наличию геномных ДНК или РНК соответствующих вирусов или бактерий.
В основе всех методов ДНК-диагностики лежат три фундаментальных принципа молекулярной биологии (рис. II.31). Это прежде всего существование комплементарных взаимодействий между двухцепочечными молекулами нуклеиновых кислот (первый принцип), которые после денатурации с последующей ренатурацией (второй принцип) позволяют им безошибочно находить друг друга и восстанавливать первоначальную вторичную структуру. Если же в процессе ренатурации нуклеиновых кислот добавить в пробы короткие олигонуклеотиды (зонды или праймеры), ковалентно соединенные с каким-либо меченым соединением, то они благодаря комплементарным взаимодействиям соединяются с тем участком нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую последовательности нуклеотидов зонда или праймера (третий принцип). Следовательно, наличие связавшейся с нуклеиновой кислотой метки с высокой точностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.
Рис. II.31. Три молекулярно-генетических принципа, лежащих в основе ДНК-диагностики
Звездочками отмечено наличие радиоактивной, флуоресцентной или другой метки в олигонуклеотидных зондах или праймерах на одном из их концов
Современные методы ДНК-диагностики находят широкое применение в медицине для обнаружения мутаций при наследственных (или приобретенных) заболеваниях и ДНК-типирования организмов (рис. II.32). ДНК-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний может заключаться как в обнаружении известных, уже описанных мутаций, так и в поиске новых мутаций, приводящих к тому же патологическому состоянию организма. ДНК-типированием называют поиск генотипических особенностей у микро- или макроорганизма, которые позволяют его идентифицировать и(или) отнести к той или иной систематической группе.
Рис. II.32. Применение методов ДНК-диагностики в медицине