- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Способы доставки новых генов в геном человека
Ретровирусные векторы. Для доставки трансгенов в организм человека в целях генотерапии ретровирусные векторы используются наиболее широко и являются одним из наиболее эффективных средств доставки генетического материала в геном человека. Специфичность взаимодействия ретровирусов с поверхностью клеток-мишеней в момент заражения обеспечивается белком оболочки их вириона, кодируемого геном env, продукт которого контактирует с белком-рецептором заражаемых клеток. Это создает предпосылки для направленного изменения круга хозяев вируса, т.е. клеток, которые он может заражать, путем изменений белка вирусной оболочки. Многие ретровирусы обладают ограниченным кругом хозяев вследствие функционирования вышеупомянутого механизма. Классическим примером такого рода является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который способен заражать лишь субпопуляцию лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор CD4.
Наиболее пристальное внимание как к средству доставки трансгенов при генотерапии уделяется вирусу лейкоза мышей Молони (MoMLV). Вирусы группы MoMLV-E обладают способностью заражать практически все исследованные клетки грызунов (вирусы с кругом хозяев, который не выходит за рамки организмов, обычно заражаемых такими вирусами, получили название экотропных). В отличие от этого вирусы группы MoMLV-А способны заражать большое число клеток млекопитающих, включая клетки человека (вирусы с широким кругом хозяев получили название амфотропных). В настоящее время разрабатываются три основные стратегии искусственного изменения тропизма (круга хозяев) вирусов этих групп, что необходимо для доставки трансгенов в клетки человека: прямое изменение последовательности нуклеотидов гена белка оболочки ретровирусов, соединение белка оболочки с новыми лигандами и псевдотипирование.
Модификации гена белка оболочки. Последовательности нуклеотидов гена env, отвечающие за взаимодействие с клеточными рецепторами, определены и могут быть непосредственно замещены последовательностями, кодирующими лиганды невирусной природы. С использованием этого подхода удалось получить химерные белки оболочки, содержащие последовательности аминокислот, изменяющие тропизм вируса. В частности, слияние эпидермального фактора роста (ЭФР) с белком оболочки амфотропного ретровируса через расщепляемую протеиназой фактора Xa линкерную последовательность аминокислот приводило к взаимодействию вирусов преимущественно с ближайшими клетками, содержащими на своей поверхности рецепторы фактора. После отщепления ЭФР протеиназой вирусные частицы начинали заражать клетки, экспрессирующие гомологичные вирусные рецепторы. Однако необходимо иметь в виду, что специфическое взаимодействие ретровирусов с рецепторами на поверхности клеток-хозяев требует образования контактов между несколькими частями полипептидной цепи белка оболочки и рецептора. Кроме того, белок оболочки ретровирусов не только обеспечивает контакт с рецепторами на поверхности клеток-мишеней, но и участвует в последующих этапах проникновения вируса внутрь клеток – интернализации в составе комплекса с рецептором. Все это затрудняет практическое использование подхода с использованием прямого замещения последовательностей аминокислот белка оболочки новыми последовательностями для эффективного изменения тропизма ретровирусов.
Соединение белка оболочки с новыми лигандами. Первые успехи на этом пути были достигнуты путем создания конъюгатов антител с белком оболочки ретровирусов с последующим соединением таких антител с антителами, специфичными в отношении антигенов поверхности клеток посредством стрептавидина. При данном подходе изменение тропизма ретровирусов было достигнуто при использовании антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, ЭФР или рецепторам трансферрина, экспрессирующимся на поверхности клеток гепатомы. Однако после интернализации вирусных частиц интеграция вирусного генома в геном зараженных клеток проходила крайне неэффективно. Предполагают, что рецептор в комплексе со связанным с ним агентом после проникновения в клеточный компартмент блокирует доступ вирусного генома к клеточному ядру, поскольку при обычной инфекции он задерживается и деградирует на поверхности клеток.
Второй подход в этой группе методов использует химическое присоединение лактозы к белкам оболочки или десиалирование гликопротеинов оболочки вируса. Оба типа модификации дают возможность модифицированным вирусным частицам специфически взаимодействовать с асиалогликопротеиновыми рецепторами, присутствующими, например на поверхности гепатоцитов. Модифицированные таким способом экотропные вирусы приобретают способность с высокой эффективностью заражать гепатоциты человека.
Псевдотипирование. При использовании этой группы методов упаковка геномной РНК ретровирусов проходит в культивируемых клетках, которые экспрессируют гетерологичный белок оболочки, замещающий обычный вирусный белок в процессе внутриклеточного формирования ретровирусных частиц. Наиболее легко замещение белка вирусной оболочки происходит при использовании гомологичных белков близкородственных вирусов. Например, геном MoMLV может быть упакован в вирусные частицы с участием белков оболочки ретровирусов C-, но не D-типа. Неэффективным в этом процессе оказывается и белок оболочки ретровируса HTLV-1. В последнем случае он включается в оболочку только в присутствии всех остальных белков дикого типа вируса MoMLV. В практических целях широкое распространение получили клеточные линии, в которых геном рекомбинантного ретровируса упаковывается в оболочку амфотропного ретровируса (с широким кругом хозяев), например MoMLV-А. В другой популярной линии клеток происходит экспрессия белка оболочки вируса лейкоза гиббонов, а также гомологичных генов gag-pol вируса MoMLV. Подобное сочетание вирусных белков позволяет получать рекомбинантный вирус, пригодный для генотерапии, в высоком титре.
Эффективный перенос ретровирусных векторов происходит только в активно делящиеся клетки, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие рецепторы. Стабильная интеграция ретровирусных векторов в геномную ДНК клеток-хозяев создает условия для длительной и эффективной экспрессии рекомбинантных генов, замещающих поврежденные аналоги. Вероятность того, что интеграция вектора в геном приведет к активации какого-либо онкогена, мала, и до сих пор это не наблюдалось в эксперименте. Размножение таких вирусов внутри клеток исключается самой процедурой их конструирования, так как они дефицитны по репликации. Ретровирусные векторы пригодны как для терапии ex vivo, так и для прямого переноса рекомбинантных генов в клетки реципиентов in vivo.
Аденовирусные векторы. В отличие от ретровирусов аденовирусы, в капсид которых упакованы рекомбинантные ДНК, способны заражать и неделящиеся клетки. Кроме того, этот тип векторов не интегрируется в геном клеток-реципиентов, в связи с чем их экспрессия внутри клеток носит временный характер. Векторы на основе аденовирусов используются в генотерапии реже.
Капсид аденовирусов представляет собой икосаэдр (правильный 20-гранник), каждая грань которого (гексон) составлена из шести идентичных белковых субъединиц, с его вершинами соединены пентоны (пентасубъединичные белки), к которым нековалентно N-концевой частью присоединены гомотримерные стержни (knobs) с глобулярными доменами на C-концах. Пять идентичных субъединиц, составляющих пентоны, содержат по одному мотиву из трех аминокислот Arg–Gly–Asp (RGD – в однобуквенном обозначении), специфически взаимодействующих с рецепторами (интегринами). Это дает возможность аденовирусам осуществлять контакт с интегринами V3 и V5 на поверхности клеток. Взаимодействие аденовирусов с клетками-мишенями происходит в два этапа. Вначале глобулярные домены стержней связываются с первичными (пока не охарактеризованными) рецепторами на поверхности клеток-мишеней, затем после взаимодействия пентонов с интегриновыми рецепторами происходит интернализация вирусных частиц. Одна из проблем специфичности доставки трансгенов с помощью аденовирусов заключается в том, что многие клетки обладают вышеупомянутыми первичными рецепторами для глобулярных доменов стержней аденовирусов. В связи с этим проводятся работы по изменению специфичности связывания глобулярных доменов стержней генно-инженерными методами. При таком подходе делаются попытки получения гибридных белков, объединяющих части полипептидных цепей белка стержней аденовирусов и белков-лигандов, например пептидных гормонов, в частности с гастрин-рилизинг-пептидом. Исследуется возможность подобного изменения белков пентона с тем, чтобы они взаимодействовали с альтернативными тканеспецифическими интегринами. Получены первые результаты, которые указывают на возможность прямой доставки трансгенов с помощью измененных аденовирусов к клеткам эндотелия и некоторым клеткам опухолей (в частности меланомы), которые экспрессируют интегрины V3. При этом исключалась возможность взаимодействия аденовирусов с клетками других типов, например эпителия, экспрессирующими интегрины V5.
Молекулярные конъюгаты векторной ДНК с лигандами. При таком подходе, используя поликатионы (например полилизин), создают комплексы очищенной векторной ДНК с лигандами. Получены молекулярные конъюгаты векторов с асиалогликопротеинами или IgA в качестве лигандов для доставки конъюгатов к гепатоцитам или клеткам эпителия дыхательных путей соответственно. Основная проблема, с которой приходится сталкиваться на этом пути, заключается в том, что конъюгаты после интернализации попадают в эндосомы, что ограничивает последующую экспрессию трансгенов. Для преодоления затруднений такого рода в состав конъюгатов пытаются включать компоненты аденовирусов, которые обладают эндосомолитической активностью. Нестабильность комплексов конъюгатов ограничивает их широкое применение в настоящее время.
Использование липосом для направленной доставки трансгенов. Направленная доставка трансгенов с использованием липосом уже испытана в различных клинических ситуациях. Основным подходом в данном направлении исследований является создание конъюгатов липосом с антителами или лигандами. Например, липосомы, объединенные с антителами к антигенам главного комплекса гистосовместимости мышей, обладают значительно большей эффективностью доставки ДНК к соответствующим клеткам-мишеням, чем липосомы сами по себе. Пептидный лиганд трансферрин был использован для направленной доставки ДНК к клеткам эритроидного ряда костного мозга, экспрессирующим на своей поверхности рецепторы трансферрина. Поскольку одним из основных требований к адресной доставке ДНК в ядра является отсутствие деградации трансгенов, часто используют объединение липосом с вирусными частицами (например вирусом Сендай или его компонентами, в частности F-частицами), которые облегчают доставку и делают ее более безопасной для транспортируемых молекул ДНК. Считают, что конечным результатом этого направления исследований должно быть создание "суперлипосом", которые в комплексе с соответствующими антителами будут специфически сливаться с мембранами клеток-мишеней, обеспечивая проникновение рекомбинантных ДНК в клетки с помощью соответствующих вирусных белков с последующим транспортом их в ядра, направляемым сигнальными пептидами ядерного транспорта. Следует упомянуть и об использовании липосом для создания так называемых виросом – вирусных частиц, содержащих векторные молекулы нуклеиновых кислот, целиком заключенных в липосомы разнообразной структуры. Такой подход используется для изменения тропизма вирусов с целью направленной доставки векторных молекул при генотерапии.