Указания к самостоятельной работе

Материал для исследования: испражнения, сыворотка крови, рвотные массы.

1. Бактериоскопическое исследование.

Из исследуемого материала готовят 2 мазка, окрашивают их по Граму и разведенным фуксином. Подвижность определяют методом «висячая» и «раздавленная» капля.

Обнаружение в мазках большого количества грамотрицательных слегка изогнутых палочек, активно- подвижных, позволяет дать предварительный ориентировочный ответ.

2. Бактериологическое исследование.

Материал (испражнения, рвотные массы) засевают на жидкие и плотные питательные среды: 1% щелочная пептонная вода, щелочной агар, среда ТЦБС (тиосульфатцитратжелчно-сахарозный агар).

Схема исследования следующая:

Испражнения сеют на 1% щелочную пептонную воду. Посев инкубируют при температуре 37ºС. Через 5-6 часов из образовавшейся пленки готовят мазки, красят по Граму и определяют подвижность методом «висячей» и «раздавленной» капли. Из 1-ой пептонной воды выросшую культуру пересевают во 2-ю пептонную воду. Ставят реакцию агглютинации с агглютинирующей О- сывороткой. Наличие грамотрицательных вибрионов, агглютинирующихся О- сывороткой, позволяет дать 2й предварительный ответ. Параллельно производят посев исследуемого материала на твердые питательные среды: щелочной агар (мелкие колонии S- формы с голубоватым оттенком) и ТЦБС- среду (колонии S- формы желтого цвета).

Чистую культуру выделяют на скошенном щелочном агаре (посевы инкубируют 10-12 часов).

Вид выделенной культуры идентифицируют по следующим свойствам:

1. Микроскопия мазка окрашенного по Граму - грамотрицательные палочки слегка изогнутые;

2. Определение чувствительности выделенной культуры к холерному бактериофагу;

3. Определение агглютинабельности противохолерной О- сывороткой и типовыми сыворотками Инаба, Огава, Гикошима.

4. Ферментация углеводов (сахарозы, арабинозы и маннозы).

Таблица 10

Тесты для дифференциации холерных вибрионов

	Тест	Классический холерный вибрион	Холерный вибрион Эль-тор
1	Агглютинация О-сывороткой	+	+
2	Агглютинация типовыми сыворотками (Огава, Инаба, Гикошима)	+	+
3	Лизис фагами: холерный фаг С (фаг IV) фаг Эль-тор	+ –	– +
4	Агглютинация эритроцитов курицы	_	+
5	Гемолиз эритроцитов барана	_	+
6	Рост на агаре с 50 ЕД полимиксина	–	+

Таким образом, идентификацию культур проводят в 3 этапа: 1) устанавливают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных вибрионов в РА с О- сывороткой, по чувствительности к специфическому фагу и другими тестами; 3)определяют видовые свойства культур.

Окончательный ответ о выделении и идентификации выделенной культуры дают через 36-48 часов.

III. Экспресс - методы диагностики.

1. Иммобилизация холерных вибрионов противохолерными сыворотками.

Методика: при помещении холерных вибрионов в сыворотку иммунную (содержит антитела против V.cholerae), они утрачивают подвижность (определяют в «висячей» и «раздавленной» капле).

2. РИФ (реакция иммунофлюоресценции).

Методика: препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе.

Положительный результат- обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто- зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки.

3. ДНК – диагностика – использование молекулярно-генетического метода – ПЦР – полимеразно-цепная реакция.