Самостоятельная работа студентов

1. Разобрать схему микробиологической диагностики туберкулеза.

2. Приготовить мазок из мокроты больного туберкулезом, окрасить по Цилю – Нильсону, промикроскопировать, зарисовать в тетрадь.

3. Изучить характер роста туберкулезных микобактерий на питательных средах (демонстрация).

4. Препараты для диагностики и профилактики туберкулеза: туберкулин сухой очищенный (РРД), вакцина БЦЖ.

Указания к самостоятельной работе

1. Бактериоскопический метод

Исследуемый материал: мокрота, моча, спинномозговая жидкость.

Мокроту помещают в чашки Петри. Петлей выбирают гнойный комочек, переносят на предметное стекло ближе к одному из концов и, растирая между двумя стеклами, готовят мазок.

Ликвор отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина, в которой находятся микобактерии туберкулеза и клеточные элементы. Мочу центрифугируют и делают мазки из осадка.

Мазки окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют, просматривая до 100 полей зрения в препарате. Микобактерии туберкулеза располагаются поодиночке или небольшими скоплениями и окрашиваются в ярко-красный цвет. Единичные микобактерии можно обнаружить в мокроте, если их содержание не менее 10⁵ в 1 мл мокроты.

Для обнаружения микобактерий в мокроте при их меньшем содержании в 1 мл применяются методы «обогащения» - гомогенизации и флотации.

Метод гомогенизации: К суточной порции мокроты добавляют равный объем 1% раствора КОН (NaOH), флакон плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают до образования однообразной массы (гомогената) в течение 10-15 минут. После центрифугирования и нейтрализации кислотой из осадка готовят мазки и окрашивают по способу Циля – Нильсена.

Метод флотации. Гомогенизированную мокроту прогревают при 55⁰С в течение 30 минут на водяной бане. Затем добавляют 1-2 мл ксилола, дистиллированную воду и повторно встряхивают в течение 10 минут и отстаивают 20 минут при комнатной температуре. Из образовавшейся «сливкообразной» пены готовят мазок, несколько раз наслаивая материал на предметное стекло по мере его высыхания. Мазок обезжиривают эфиром, фиксируют нагреванием и окрашивают по Цилю – Нильсену.

РИФ. Окраска флюорохромом основана на способности липидов микобактерий воспринимать эти красители. В зависимости от красителя (родамин или аурамин) M.tuberculosis дают ярко-красное или золотисто-желтое свечение на темно-зеленом фоне.

2. Бактериологическое исследование. Исследуемый материал перед посевом в течение нескольких минут подвергают действию 10% H₂SO₄ или 5% раствора NaOH для освобождения от сопутствующей микрофлоры, затем тщательно встряхивают и центрифугируют.

Обработанный материал засевают на несколько пробирок со средой Левенштейна-Йенсена (или с другими элективными средами). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37⁰С в течение 3-4 недель. Вирулентные культуры дают бородавчатые, морщинистые колонии (R-форма) через 21-28 дней.

Из них готовят мазки, окрашивают по Цилю-Нильсену и проводят идентификацию по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Из биохимических свойств, чаще всего определяют способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту (ниациновая проба Коно).

Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5% раствора хлорамина. При наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Это один из важных признаков с помощью которого удается отличить M.tuberculosis, хорошо синтезирующие никотиновую кислоту, от M.bovis, образующих ее в минимальных качествах.

Ускоренный метод диагностики туберкулеза – метод микрокультур по Прайсу.

Для этого на нескольких предметных стеклах готовят толстые мазки из исследуемого материала. Мазки обрабатывают 2-6% серной кислотой, при этом сопутствующая микрофлора погибает, а микобактерии сохраняют жизнеспособность. Затем мазки тщательно промывают стерильным физиологическим раствором и помещают во флаконы с жидкой питательной средой (цитратная кровь) – сохранившиеся жизнеспособные микобактерии размножаются. Через 7-14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют. Вирулентные штаммы микобактерий образуют микрокультуры, имеющие вид жгутов или кос (корд-фактор).

Определение чувствительности к антибиотикам и химиопрепаратам проводят методом серийных разведений.

3. Биологический метод применяется для выделения чистой культуры возбудителя из органов лабораторного животного, а также для определения вирулентности микобактерий. Исследуемый материал предварительно обрабатывают серной кислотой для освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят подкожно морской свинке и кролику с отрицательными туберкулиновыми реакциями. Через 4 месяца, если животное не погибнет, его забивают и проводят макро-микроскопическое исследование органов, делают посевы. К M.tuberculosis восприимчивы морские свинки и не восприимчивы кролики. M.bovis высокопатогенны для кроликов.

4. Серологическая диагностика применяется с целью обнаружения антител. С этой целью могут быть использованы различные реакции иммунитета: РСК, РПГА, РИФ, ИФА. Положительные результаты отмечаются не только при активном туберкулезе, но и при инфицировании микобактериями туберкулеза, а также при вакцинации.

5. Кожно-аллергическая проба ставится с туберкулином – очищенной белковой фракцией (РРД), полученной из микобактерий туберкулеза. Туберкулин вводят внутрикожно (проба Манту). Результат учитывают через 24-48-72 ч по образованию гиперемии и папулы. Аллергическая проба Манту применяется для выявления инфицированных лиц, для оценки напряженности иммунитета, отбора контингентов, подлежащих ревакцинации.

Таблица 19