Regulace buněčného cyklu

a)

Cykliny a nacyklinech závislé proteinkinázy (Cyclin-DependentProteinKinases;Cdk-proteinkinázy)-proteiny,které jsou součástí řídícího systému buněčné ho cyklu

1. 8cyklinů(A,B,C,D,E,F,G a H)-v jednotlivých fázích buněčného cyklu jsou přítomny určité typy cyklinů (cyklin D v G1 fázi, cyklin A v S fázi)

2. 7typů Cdk-proteinkináz - Cdk proteiny vykazují odlišné funkce v závislosti na fázích buněčného cyklu

3. fosforylují seriny a threoniny cílových proteinů

4. Účinnost Cdk-proteinkináz závisí na vytvoření komplexu s cykliny a na vazbě s PCNA (ProliferatingCellNuclearAntigen)

5. Inhibovány jsou působením inhibitorů proteinkináz

Regulace: Cdk1+cyclin A a Cdk1+cyclin B jsou charakteristické pro mitózu (ale jejich syntéza začíná v G2 fázi)

b) gen RB1

• Tumor-supresorový genRb1-aktivní téměř ve všech somatických buňkách; v průběhu buněčného cyklu se střídá fosforylace a defosforylace Rb proteinu

• Rbprotein(pRb)-jaderný transkripční faktor,regulace buněčného cyklu,diferenciace,indukce apoptózy

• Inhibiční usměrňování přechodu z G1 do S fáze

• Nefosforylovaný pRb je aktivní-váže se s multifunkčními transkripčními faktory rodiny E2F – inhibuje jejich činnost

• Neaktivní fosforylovaná forma Rb proteinu – uvolnění vazby s faktory E2F

Gen TP53

• Zastavení b. cyklu v kontrolním bodě G1

Protein P53

• Je to jaderný fosfoprotenin, jaderný transkripční faktor pro mnoho genů významných při regulaci buněčného cyklu

Krevně skupinové systémy jejich dědičnost biologický význam

A) AB0 systém -> objevitel Jan Janský

• Monogenně děděný znak

• fenotyp A, B, 0, AB

• genotyp AA, A0; BB B0; 00; AB

• vztah alel: A k B; B k A -> kodominance (oba se projeví stejně)

A k 0 a B k 0 -> dominantní (ve fenotypu se projeví pouze A,B)

0 k 0 recesivní vztah

• Nejvýznamnější kritérium pro dělení krve do skupin je tzv. systém AB0. Lidská krev se dělí podle přítomnosti antigenů A a B:

• krev typu A, která obsahuje antigen A a protilátky anti-B

• krev typu B, která obsahuje antigen B a protilátky anti-A

• krev typu AB, která obsahuje antigeny A i B a neobsahuje protilátky anti-A ani anti-B

• krev typu 0, která neobsahuje antigeny A ani B a obsahuje protilátky anti-A i anti-B

• biologický význam: transfúze - Při krevní transfúzi je životně důležité použít pouze krevní skupinu, která příjemce nepoškodí

• B) MN systém

• C) RH systém

Metody analýzy dna

U DNA zjištujeme podstatu konkrétních proteinu, popř. mutace, polymorfizmy, podobnost DNA mezi druhy a její vlastnosti

DNA izolace, detekce DNA a analýza

PCR – polymarase Chain reaction

• Nobelova cena za její objev v roce 1984

• obdoba DNA replikace, která se odehrává v buňkách

• amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DNA

• u oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí

• cyklické střídání těchto teplotních kroků:

• denaturace – dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (vliv teploty či chemických činidel)

• annealing (čti anýlink)– ke koncové oblasti vybraného úseku se přiloží primery (cca 20bp dlouhé oligonukleotidy – jednovláknové řetězce)

• elongace – prodloužení primeru vkládáním jednotlivých dNTP (A,G,C,T) podle komplementarity k templátové DNA

• v reakci: tepmlát, taq-polymeráza, primery, nukleotidy a pufr

• z jednoho cílového lokusu – dvojnásovek DNA fragmentu

• matematicky – 2 na entou kde n je počet cyklů

RFLP

• charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DNA restriktázami

• jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty

• každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy)

• Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů

SOUTHERN - BLOTTING

• jméno po objeviteli Southernovi

• v doslovném překladu pijákování – tzn. nasátí PCR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza

• hybridizace = spojení dvou jednovláknových DNA podle pravidla komplementarity

• gel se denaturuje v chemickém činidlu – tím se denaturuje i dvouvláknová DNA a na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna a to v takovém uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu

• následuje hybridizace s radioaktivně značenou próbou – membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DNA

• na základě komplementarity buď dojde nebo nedojde k hybridizaci

• nenavázaná próba je odmyta – v případě úspěšné hybridizace svítí na membráně v určité oblasti dvoušroubovice tvořená jedním vláknem ze studované DNA a jedním vláknem próby

• umožňuje z velkého množství fragmentů podobných délek (např. po štěpení celkové DNA restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DNA fragment

Elektroforéza

• metoda, která slouží k rozdělení naamplifikovaných DNA fragmentů o nestejné délce

• DNA má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě

• rychlost putování je závislá na její celkové délce

• gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody – v gelu u záporné elektrody jsou jamky, do kterých se dává vzorek DNA – pustí se elektrický proud – po čase se fragmenty rozdílných délek rozdělí – vizualizace fragmentů se provádí například ethidiumbromidem (interkalačního činidla), které svítí v UV světle

Sekvence – fragmenty se mohou lišit po PCR i o jeden nukleotid

Sangerova metoda – chemicky modifikované dNTP na ddNTP, které postrádají OH skupinu na 3 konci, za ddNTP si při elongaci už nemůže přisednou žádný normálmí nukleotid a dojde k terminaci elongace