Hybridizace dna, využití sond

Hybridizace DNA in situ -> slouží při vyšetření FISH

Počet chromosomů lze stanovit běžnými mikroskopickými technikami pomocí vhodného cytogenetického barvení. Složitější již je umisťování genů na jednotlivé chromosomy. Za tímto účelem byly vyvinuty speciální metody (hybridomová metoda), kdy se vytvářely buněčné kultury s kombinovanou chromosomovou výbavou (například člověka a myši). V těchto kulturách se postupně eliminovaly lidské chromosomy (nebo jejich části) a vyhodnocovala se přítomnost produktu sledovaného v závislosti na zbylých chromosomech (pokud v buňce zbyl pouze jeden lidský chromosom a produkt hledané genu se stále tvořil, potom bylo možné tento gen lokalizovat na onen chromosom). Tato metoda byla velmi zdlouhavá a vyžadovala velikou zkušenost.

Známe-li proteinový produkt genu, můžeme zkusit z primární struktury - tedy pořadí aminokyselin - sestavit sekvenci nukleotidů, které by toto pořadí kódovaly. Nyní můžeme zkusit, zda takto vytvořené sondy budou hybridizovat s nějakou sekvencí na některém chromosomu. Využíváme při tom metody in situ hybridizace, kdy necháváme hybridizaci proběhnou takříkajíc "na místě" - tedy například přímo na podložním sklíčku mikroskopu, ve kterém můžeme rovnou sledovat, zda na některém chromosomu značená (např. fluorescenčním barvivem) sonda hybridizuje.

Využití DNA sond (denaturovaná jednovláknová DNA, která je schopna se na základě komplementarity vázat k cílové sekvenci); Dna sonda je předem označena některým fluorochromem (Texas red)

+ ot. č. 17

43. Rekombinace, vazba úplná, neúplná – význam pro diagnostiku

Viz ot. č. 1 a 14

Hybridizace DNA, využití sond

Viz ot. č. 17 a 42

Transplantace a odezva imunitního systému

44. Genotyp a fenotyp, vztahy alel

• Genotyp – soubor všech alel jedince

• Fenotyp – soubor všech znaků jedince v užším slova smyslu konkrétní forma znaku, určován genotypem a může být ovlivněn i prostředím

• Vztah alel

  • Alely-různé formy genu odpovědné za jeho odlišné projevy

  • Více forem genu -mnohotná alelie, polymorfismus (např. krevní systém AB0, transplantačních antigeny)

  • Shodné alely -homozygotní stav; dominantní homozygot (AA), recesivní homozygot (aa)

  • Dvě odlišné alely (Aa) -heterozygotní stav

  • Alely téhož genu mohou mít vůči sobě vztah:

    • Úplné dominance a recesivity; fenotyp jedince určuje dominantní alela již v jedné dávce.

    • Fenotyp odpovídající recesivní alele -recesivní homozygoti

    • U mužů u genů lokalizovaných na heterochromosomu X hemizygotní stav (pseudodominance)

    • neúplné dominance-fenotyp heterozygota není shodný s fenotypem homozygotů

    • kodominance-genový produkt obou alel se rovnocenně projeví ve fenotypu (např. krevní skupiny AB nebo MN, alely HLA komplexu)

Typy geneticky podmíněných nemocí

Farmakogenika a nutrigenetika

Viz ot. č. 12

45. Polymorfismus HLA systému

Populační genetika, malé a velké populace

Mutageny, teratogeny

46. Mutace, rozdělení význam

Oogeneze, spermiogeneze

Imunitní systém člověka

47. Nádorová onemocnění

Analýza nukleových kyselin

Viz ot. č. 3

Poruchy funkce imunitního systému, asociace chorob a alelami HLA lokusu

Autoimunitní onemocnění – některá ze složek imunitního systému reaguje na struktury organizmu vlastní. Imunitní odpověď na tělu vlastní antigeny.

Roztroušená skleróza

Více ženy než muži

Věk 20-40 let

Zánět mielinu (bílé hmoty) – porušení fce axonů – mozek, mícha

Asociace HLA DR

Revmatoidní artritida

Zejména ženy

25-30 let

Chronická, zánětlivá destruktivní choroba

Infiltrace kloubního prostředí zánětlivými bunkami

Výskyt 1%

Asociace HLA DR4, HLA DR1

Morbus Brechtův

Ankylující spondylitida ( degenerativní onemocnění kloubů a páteře)

Asociace s alelou HLA-B₂₇

Frekvence alely HLA-B₂₇ u zdravého jedince je 9,4% a u nemocného 90%

Postižení zejména muži od 25 let

Vysvětlení asociace podobnost antigenu klebsiel s antigenem B27 – nedostatečná odezva imunitního systému na infekci patogenem

48. Geneticky podmíněné choroby a jejich členění

Buněčný cyklus a jeho regulace

Struktura nukleových kyselin

49. Autosomálně dominantní onemocnění; polycystická choroba ledvin, hypercholesterolémie, Huntingtonova chorea

Polycystická choroba ledvin; 1/600-1000

• Mutace genu PKD1 (protein polycystin)

• Do dospělosti žádné symptomy

• Později vysoký krevní tlak, krev v moči, bolest v břišní dutině, infekce močových cest, selhání činnosti ledvin

• 1/3 pacientů – cysty v játrech

• 10% pacientů rozšíření (dilatace) žil v mozku → mozkové příhody

• Léčit infekce, regulovat tlak krve, dialýza, transplantace ledvin

Hypercholesterolemie (1/500 heterozygotů) - mutace v genu kódujícím receptor pro LDL (low density lipoprotein) ® v cytosolu změna struktury receptoru

• LDL – komplex proteinu a lipidu; hlavní transportní protein cholesterolu

• Cholesterol vstupuje do buněk endocytózou - pomocí clathrinu ® fúze s lysozomy ® proteinová a lipidová složka LDL se zde hydrolýzou oddělí na aminokyseliny, cholesterol, mastné kyseliny

• Exogenní cholesterol po vstupu do buňky potlačuje syntézu endogenního cholesterolu ® udržování vyvážené hladiny

• Mutace receptoru ® cholesterol cirkuluje v krvi ® ateroskleróza, infarkt (35- 40 let), úmrtí – 60 let

Huntingtonova chorea (HD) - mutace v genu kódujícím protein huntingtin (expanze trinukleotidů - CAG)

• 5’ konec genu ® 10 – 34 repetic CAG

• Pacienti 42 – 100 CAG repetic

• CAG = kód pro glutamin

• 1/10000 - 20000

• Postižení nervových buněk mozku; ve středním věku mírné změny osobnosti, během 10-20 let postupná ztráta kontroly mentálních a fyzických schopností

• HD není léčitelná; některé symptomy lze léky zpomalit

Typy mutací, význam mutací

Embryonální vývoj a jeho poruchy

Viz ot. č. 49

50. Vývojové vady, příčiny vzniku

Stárnutí organizmu

Genetické poradenství, prenatální péče

• genové poradenství:

• v rodinách, kde je vysoká přítomnost určitého znaku, ale dědičnost neodpovídá Mendelovým pravidlům (– neodpovídá riziko opakování viz AD, AR, GD, GR dědičnost) je podezření na polygenní genetickou podstatu

• polygenní dědičnost – nedědí se choroba, pouze předpoklad pro její manifestaci – DISPOZICE (~predispozice)

• pro určení pravděpodobnosti rizika projevu dané choroby byl vypracován tzv. Edwardsův vzorec či tabulky empirických rizik

• prahová hodnota ® manifestace znaku

• u některých polygenně děděných chorob hraje roli věk postiženého či pohlaví

• stenóza pyloru 5x častější u chlapců

• luxace kyčelního kloubu 5x častější u dívek

• prevence:

• zlepšení životního prostředí vede ke zvýšení prahové hodnoty ® nižší pravděpodobnost postižení

• prenatální screening

(ultrazvuk, hladina a-feto-proteinu), rodinný ochranný režim

Základní je vyšetření gynekologické, vždy je kontrolován krevní tlak, zjišťována hmotnost těhotné a orientačně vyšetřena moč. Opakovaně je odebírána krev. Cílem je především zjistit krevní skupinu a Rh-faktor těhotné, zhodnotit její krevní obraz a zjistit, zda těhotná neonemocněla některými infekčními nemocemi, které by mohly vyvíjející se plod poškodit nebo mu způsobit problémy po porodu. V 16. týdnu těhotenství se také odebírá krev na vyšetření, které má vytipovat malou skupinu těhotných žen, jejichž plod by mohl být ohrožen vrozenou vývojovou vadou. V 36. týdnu těhotenství by téměř každá těhotná měla mít proveden výtěr z pochvy. Podle jeho výsledku jsou pak v určitých případech během porodu preventivně podána antibiotika, aby byl novorozenec ochráněn před možnou nákazou. Od 24. týdne mohou být poslouchány ozvy plodu (poslech srdce plodu). U normálně probíhajícího těhotenství je pak zhruba od 35. týdne natáčen takzvaný kardiotokograf (KTG, CTG). Je to záznam, na němž jsou dvě křivky. Horní označuje srdeční frekvenci plodu, podle dolní se hodnotí přítomnost či nepřítomnost děložních stahů (kontrakcí).

Mutace

Selekce Náhodná trvalá dědičná změna genetického materiálu

•Chromosomová (např. zlom)

•Genová (např. bodová mutace)Mutace

•tolerované (přírodní výběr)neutrální (neovlivňují reprodukční schopnost nositele)výhodné(zvyšují reprodukční schopnost nositele, zlepšují stávající funkce –např. duplikace genů

•nevýhodné (ztráta nebo porucha funkce genu)

•zakázané (letální –neschopnost reprodukce)Každý jedinec –12 genů s nevýhodnými recesivními mutacemi -z nich 3-5 genů v homozygotní formě je letálníchFrekvence mutací u lidí –10-6–10-5

Mutagenní faktory

Mutace spontánní:

chyby při replikaci –bodové mutace

inekvální crossing-over –delece, duplikace

poruchy mitózy/meiózy –monosomie, trisomie …

Indukované: vyvolané zevními vlivy (mutageny)

fyzikální-ionizující záření (gamma, rtg), UV

chemické-polycyklické aromatické uhlovodíky, nitrosaminy, mykotoxiny, těžké kovy (chrom, nikl, arsen, rtuť), azbest

biologické –např. papiloma viry, některé adenoviry a herpes-viry

Bodové mutace

Záměny basí

a)Neutrální (tiché mutace)

b)Záměna aminokyselin v polypeptidu

c)Předčasná terminace

Delece→ posun čtecího rámce

Inserce→ posun čtecího rámce

Duplikace

Působením mutací mohou vznikat

a)nové alely daného genu → variabilita znaku

b)škodlivé mutace

c)letální mutace

Mutace na úrovni úseků DNA

Delece

Inserce

Translokace

Duplikac

Intervize