ннолошн

ИВ.Березин

НЛ.Клячко

АВ.Левашов

_{К.Мартинек}

_{ВВМожаев}

^{Ю.Л.Хмельницкий}

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

, *\ т • ^|«1«1, t

•* .•

. • *_ . •

•*.*•-»

i *•■*••*•

•Л *Л-'Л :"*"««*

. • •. *

■■■■>•■

-■£■■*■

_г

<■•••*»*•■

_{ШОТЕННОЛОШН}

_ел

_{UIUDUDHH3iDng}

_{в8-ми книгах}

_{ШОТЕННОЛОШР!}

^{Под редакцией НС Егорова}

ВДСамуилова

^{И.В.Березйн|}

_{HJ 1.Клячко}

_{АВЛевашов}

КМартинек

_{ВЯМожаев}

_{ЮЛХмельницкий}

Москва «Высшая школа» 1987

^МОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

ББК 30.6 Б63

УДК 574.6

Рецензенты:

кафедра биотехнологии микробного синтеза Московского технологиче­ского института пищевой промышленности (зав- кафедрой проф. Кан-тере В. М_г) и д-р техн. наук Попов В. Г. (ПО *Биопрепарат»)

ю Министерством высшего и среднего специального образо­вания СССР в качество учебного пособия для студентов биологических специальностей высших учебных заведений.

Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн./Под Б63 ред. Н. С. Егорова В. Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобили­зованные ферменты/[И, В. Ьсрезин|, Н. Л. Клнчко, А. В. Ле­вашов и др. — М.: Высш. шк., 1987. 159 — с.: ил.

Рассмотрены неорганические и органические носители (пилложки), хими­ческие к физические способы связывания белков (ферментов)- Проанализиро­ваны ки нети ко термодинамически особенности катализа иммобилизованными ферментами, их стабильность и другие физнко-кимичес&не свойства.

2010000000(4309000000) 510 ББК 30.6 + 28.07

Б КБ—53—9—86 iinz.

001 (01)-87 ^

© Издательство «Высшая школа», 1987

_{ПРЕДИСЛОВИЕ}

В последние 10—15 лет на стыке ряда химических и биологи­ческих дисциплин сформировалось новое научно-инженерное на­правление — химическая энзимология. Стремительное развитие химической энзимологии обусловлено созданием нового типа ге­терогенных биоорганических катализаторов — иммобилизован­ных ферментов. Целесообразность исследований в этом направ­лении и важность внедрения иммобилизованных ферментов в практику подчеркнуты постановлением ЦК КПСС и Совета Ми­нистров СССР «О дальнейшем развитии физико-химической био­логии и биотехнологии и использовании их достижений в меди­цине, сельском хозяйстве и промышленности» (1981), а также в последующих постановлениях.

Проблема создания промышленных образцов иммобилизо­ванных ферментов объединяет необычайно широкий круг спе­циалистов самого разного профиля. Это, в свою очередь, ставит перед высшей школой задачу подготовки таких специалистов.

К настоящему времени в мировой и советской научной ли­тературе имеются десятки обзоров, сборников и монографий, посвященных получению, свойствам и использованию иммобили­зованных ферментов. Однако, как правило, эти издания рассчи­таны на узкий круг специалистов, имеющих соответствующее образование в области физической химии ферментов или инже­нерной энзимологии. Учебных пособий для более широкой ауди­тории в отечественной литературе нет.

Цель настоящего учебного издания состоит в том, чтобы по возможности в общедоступной форме рассмотреть современное состояние проблемы иммобилизованных ферментов, наметить пу­ти решения ее ключевых вопросов и дать верную ориентацию в этой области,

В составлении настоящего учебного пособия принимали учас­тие И. В. Березин (предисловие, введение, заключение), Н. Л. Клячко (гл. I, VI), А. В. Левашов (гл. III), 1С Мартинек (предисловие, введение, заключение), В. В, Можаев (гл. IV, V, VI), Ю. Л. Хмельницкий (гл. II). Редактирование этой книги проведено И. В. Берез иным и А. В, Левашовым.

Авторы выражают глубокую благодарность рецензентам: Д-ру техн. наук В. Г. Попову и кафедре биотехнологии микробного синтеза Московского ордена Трудового Красного знамени тех­нологического института пищевой промышленности (зав, кафед­рой проф. В. М. Кантере) за ценные замечания и советы.

Авторы

_{ВВЕДЕНИЕ}

Ферменты и ферментативные системы традиционно приме­няются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой_, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, орга­ническом синтезе, химическом анализе и т. д. Тем не менее раз­витие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось доро­говизной или полным отсутствием на мировом рынке нужных ферментов, особенно их чистых препаратов. Очевидно, можно ожидать в недалеком будущем благодаря успехам микробиоло­гии коренного решения вопроса производства соответствующих ферментов в достаточном количестве.

Возможности применения ферментов осложнены, кроме того, еще, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях, особенно тепловых. Во-вторых, многократное использование фер­ментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции. По этим причинам практическое использо­вание ферментов могло быть ограничено, но уже на сегодняшний день найдены пути решения и этих проблем.

Принципиально новые перспективы открылись перед приклад­ной энзимологией в результате создания иммобилизованных фер­ментов, Дж, Нельсон и Е. Гриффин еще в 1916 г. показали, что инвертаза, адсорбированная на угле (т. е. иммобилизован­ная), сохраняет каталитическую активность. В 20—30-х годах работы по изучению адсорбции белков и ферментов были про­должены, однако исследования этого периода представляли глав­ным образом академический интерес и не преследовали практи­ческих целей. В 1939 г. Дж. Пфанмюллер и Г. Шлейх получили первый патент на применение адсорбированных на древесных опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Прин­ципиально важный шаг в направлении создания прочных конъюгатов ферментов с носителями был сделан в 1953 г. Н. Грубхофером и Д. Шлейтом. впервые применившими метод ковалентного связывания.

Для исследований 50—60-х годов характерна уже достаточно четкая осознанность практической значимости развиваемого на­правления. Немалая заслуга в этом принадлежит группам

Г. Манеке и Э. Канальского. В результате связывания фермента на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для кото­рых на первой конференции по инженер­ной энзимологии в Хенникере (США) в 1971 г., был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». В литературе все еще встречаются и другие термины, например «нерастворимые фер­менты», «матрицированные ферменты» и т. п., смысл которых достаточно конкретен: ими обозначают препараты ферментон, связанных на нерастворимых носителях. Однако понятие «иммо­билизация* можно и нужно понимать шире, а именно, как любое ограничение свободы движения белковых молекул (или их фраг­ментов!) в пространстве. Помимо связывания с нерастворимым носителем этого можно также достичь, например, путем внутри­молекулярной или межмолекулярной «сшивки» белковых молекул низкомолекулйрными бифункциональными реагентами или же присоединением фермента к растворимому полимеру. Такие пре­параты иногда называют ферментами, модифицированными «сшивающими» или, соответственно, полимерными реагентами.

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками. Во-пер­вых» гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент реакцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов поз­воляет проводить ферментативный процесс непрерывно* напри­мер в проточных колоннах, и регулировать скорость катализи­руемой реакции, а также выход продукта путем изменения ско­рости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента спо­собствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макро-молекулярным субстратам), зависимости каталитической актив­ности от рН> ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям. Отметим» что крупный вклад в разработку общих принципов стабилизации ферментов был сде­лан советскими исследователями.

В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факто­ров, таких, как свет или звук. На этой основе создаются механо-и зву ко чувствительные датчики, усилители слабых сигналов и бессеребряные фотографические процессы.

В результате внедрения нового класса биоорганических ката­лизаторов— иммобилизованных ферментов» перед прикладной энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути разви-

тия. Одно лишь перечисление областей, в которых находят при­менение иммобилизованные ферменты, могло бы занять немало места. Однако в этом нет необходимости, поскольку прикладным аспектам и достижениям инженерной энзимологии целиком по­священа книга 8 серии «Биотехнология». Здесь важно лишь от­метить, что успех практического использования препаратов им­мобилизованных ферментов в значительной степени определяется подготовительным этапом работы — выбором подходящего носи* теля и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термо-динамических особенностей катализа иммобилизованными фер­ментами. Именно рассмотрению этого круга вопросов посвящено данное учебное пособие. Кроме того, уделено внимание пробле­мам стабильности ферментов вообще и иммобилизованных в частности, а также сформулированы общие принципы стабилиза­ции. Специальная глава отведена способам регенерации компо­нентов систем с иммобилизованными ферментами.

_Глава

_{НОСИТЕЛИ}

_{ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ}

_{ФЕРМЕНТОВ}

Для получения иммобилизованных ферментов используется огромное число носителей, как органических, так и неорганиче­ских. Основные требования, предъявляемые к материалам, кото­рые могут быть применены для иммобилизации ферментов, сле­дующие (Дж. Порат, 1974): 1 —высокая химическая и биологи­ческая стойкость; 2 — высокая механическая прочность (в пер­вую очередь» по отношению к истиранию); 3 — достаточная про­ницаемость для фермента и субстратов, большая удельная по-верхность, высокая вместимость, пористость; А — возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран» труб, листов и т. д.); 5 — легкое переведение в реакционноспособную форму (активация); б — высокая гидро-фильность, обеспечивающая возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде; 7 -■ невысо­кая стоимость. Отсутствие носителей, удовлетворяющих одно­временно всем этим требованиям, и разнообразие задач, стоя­щих перед экспериментаторами, обусловливают широкий набор применяемых для иммобилизации материалов.

ОРГАНИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НОСИТЕЛИ

Существующие в настоящее время органические полимерные носители можно разделить на два класса: 1 — природные поли­меры, 2 — синтетические полимерные носители. В свою очередь класс природных полимеров можно подразделить на группы в соответствии с их биохимической классификацией: полисахарид-ные, белковые и липидные носители. Синтетические полимеры также могут быть подразделены на группы, например, в соот­ветствии с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиле но вые, полиамидные и полиэфирные носители.

К рассматриваемым носителям предъявляется ряд дополни­тельных требований, обусловленных методом иммобилизации, свойствами иммобилизуемого фермента и способом дальнейшего

использования препарата: I — при ковалеитной иммобилизации носитель должен связываться только с теми функциональными группами на белке, которые не являются ответственными за катализ, и 2 — они не должны оказывать ингнбнрующего дей­ствия на фермент. При проведении иммобилизации необходимо также учитывать, что наличие противоположных знаков заряда на носителе и ферменте облегчает связывание фермента, одно­именных — затрудняет; уменьшение размера частиц носителя способствует увеличению количества связанного препарата.

Наиболее широко используются для иммобилизации фермен­тов природные полисахариды и синтетические носители поли-метиленового типа. Остальные типы носителей применяются зна­чительно реже.

Рассмотрим основные классы полимерных носителей.

§ 1. Природные носители

Большое значение природных полимеров в качестве носите лей для иммобилизации объясняется их доступностью и нали­чием реакционно-способных функциональных групп (в исходном или модифицированном препарате), легко вступающих в раз­личные химические реакции, а также высокой гидрофильностыо. К недостаткам природных носителей можно отнести неустойчи­вость к воздействию микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них.

Полисахариды. Наиболее часто для иммобилизации исполь­зуют целлюлозу, декстран, а га розу и их производные.

Целлюлоза представляет собой поли-],4-Р-£>-глюкопиранозил-£>-глкжопиранозу

Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности, а наличие большого числа гндроксильных групп дает возможность ее легко модифицировать путем введения различных заместите­лей. Препараты целлюлозы для придания им химической устой­чивости «сшивают» эпихлоргидрнном. Для увеличения механиче­ской прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидро­лиза, в результате которого разрушаются ее аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированная целлю­лоза благодаря простоте получения, сравнительно низкой стои­мости относится к удобным носителям для иммобилизации ферментов и аффинной хроматографии.

Гранулированную целлюлозу довольно легко превращают в

ю

Таблица L Целлюлоза и некоторые ее производные

Заместитель по ОН-групие

Название препарата

Фирма

NH:

0<CH_a)_aNH₅

ОРОаН

ОСНаСООН O(CH_a)_aNH*

Целлюлоза

Аминоэтялцеллюлоза

Фосформл целлюлоза (Р-10)

Целлюлоза

Диэтиламиноэтнлцел-поза

Карбокснметнлцеллю-за

А м нноэтил цел л юл оэа

п -Амин обензон л целлю­лоза

«Whatman» (Англня)

То же

«Sigma» (США)

*Bk)-Rad-Labs>

(США)

ОСОСН,Вг

O(CH₂>aN(C_aH₅h

OCH^CONHNHs ОСОСНгВг

Бром аиетн л целл юлоэа

Бенэонлдиэтнламнно

этнлцеллюлозз

Г ндразидка рбокснметнл -

целлюлоза

Ьромя цетил целл юлояа

* ~ Ам ннобензилоксн ме­тил цел л юлоэа

«Serva» (ФРГ) «Reanal» {ВНР)

То же

«Miles Labs» (Англня)

То же То же

I NHs

O(CH₅)₂N(C*H₆)_a

OCHjCOOH

NH?

осн.

O(CH_a)_aSO₃H O(CH_ahfi(C_aH_sb

Д Э АЭ - пел л юл оз а

КМ- целл юлоза

п-А мн н обензнл целлюлоза

С ул ьфоэтнл целл юл оза

Триэтил аммоннйэтнл-

цел.пю;киа

НПО «Биохим-реактнв»

То же

различные ионообменные производные, В табл. I приведены основные промышленные марки целлюлозы, выпускаемые различ­ными фирмами.

Недостатком целлюлозы как носителя можно считать ее не­устойчивость к воздействию сильных кислот, щелочей н окнсли-телей.

Хитин-—природный аминополнсахарид. Его можно рассмат­ривать как целлюлозу, в которой СН^ОН-группа заменена ацет-амндным остатком:

И

СН₂ОП

сн, он

JO

(в хитине R=

в хитозане R =—Н)

Хитин — основной компонент наружного скелета ракообраз­ных, насекомых, а также клеточных оболочек некоторых грибов. Это соединение является отходом промышленной переработки креветок и крабов, поэтому доступно в больших количествах при относительно низкой стоимости.

Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических растворителях. Для переведения в реакционноспособную форму он может быть модифицирован глутароиым альдегидом, а также солями тяжелых металлов [например, Ti(IV)].

Обработка хитина концентрированными растворами щелочей (деацилирование) приводит к образованию хитозана. Хитозан, имеющий свободные аминогруппы, может использоваться для ковалентной иммобилизации ферментов с помощью таких би­функциональных реагентов, как диа льде гиды, диизоцианаты (см, гл. ill). В отличие от хитина хитоэан растворяется в минераль­ных и органических кислотах, поэтому для иммобилизации он часто применяется в виде растворов (рН 3—7).

Употребление хитоэана в качестве носителя дает хорошие результаты, так как полученные препараты иммобилизованных ферментов обладают высокой каталитической активностью и ус­тойчивостью к микробному воздействию; наблюдается также су­щественное повышение термостабильности белков» иммобилизо­ванных на хитозат'.

Декстран — поли-1,6-а-/)-глюкопиранозил-0-гл1ОКопирано-за — разветвленный полисахарид из бактериальных источников, содержащий остатки глюкозы, связанные, в основном, 1,6-глюко-знднымн связями (а также, 1,2-, 1,3- и 1,4-связями):

12

Гели на основе декстрана, сшитые эпихлоргидрнном» вы­пускаются фирмой «Pharmacia» (Швеция) под названием «сефа-декс» и «Reanab (ВНР) под названием кмолселект». При вы­сушивании сефадексы легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Эти качества выражены тем сильнее, чем меньше процентное содержание сшивки. Изменением доли сшив­ки регулируется средний размер пор, образуемых пространст­венной сеткой геля.

Следует отметить, что продажные препараты сефадексов со­держат небольшое количество карбоксильных групп, что придает им некоторое сродство к катионам Этот факт необходимо учи­тывать при иммобилизации металлозависимых ферментов.

Обращают на себя внимание такие свойства гелей на основе декстрана, как высокая химическая стойкость и гидрофиль-ность (из-за наличия большого количества гидроксильных групп), Сефадексы G-типов различаются по степени сшитости и, следовательно, по степени набухания и по пористости. Сущест­вуют разновидности модифицированных сефадексов для исполь­зования в органических растворителях (LH-20 н LH-60).

Фирмы «Pharmacia» и «Reanab выпускают также ряд произ­водных декстрана, содержащих различные функциональные груп­пы (табл. 2),

К группе декстранов можно отнести крахмал, являющийся смесью полисахаридов, основным компонентом которой является амилоза — поли-1,4-а-£)-глюкопиранозил-£) -глюкопираноза и амилопектин — разветвленный полисахарид, состоящий из остат­ков £>-глюкозы, связанной 1_т4-а-глюкозидными связями, а в мес­тах разветвлений — 1,6-оглюкозидными связями.

Химической модификацией крахмала сшивающими агентами, такими, как формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид» по­лучен новый носитель — губчатый крахмал, обладающий повы­шенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизую-

Таблица 2. Коммерческие препараты производных декстрана

Функциональная группа

Название и марка

Фирма

ОСНгСООН

OCH₂CH*N ( —СН(ОН)СН_Э

OCHsCOOH

Карбо кс и мети л сефа деке (СМ)

Сульфоп ропнлесфадекс <SP)

Д иэтил а м н ноэти л сефа -деке IDEAE)

Днэтщ] (2-окси пропил) амнноэтнлсефадекс (QAE)

Молселект (СМ)

Молседект (SE)

Молсе-лект (DEAE)

«Pharmacia» (Швеции)

«Reanal» (ВНР)

щим полисахариды. Введение днэтаиол- и триэтаноламиннык групп дает возможность применять губчатый крахмал для им­мобилизации различных ферментов.

На основе декстранов могут быть получены водораствори­мые препараты с различными функциональными группами, при­меняемые в медицине как носители лекарственных веществ. Вы­бор носителей иа основе декстрана для медицинских целей обус­ловлен, в частности» тем, что они легко подвергаются биодегра-дзции.

Агароза ■— поли-{5-галактопиранозил*3,6-ангидро-а-/^галакто*-пираноза:

Она широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость агарозы довольна высока, поэтому разраба­тываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2—6%-ного водного раствора агарозы до температуры ниже 45°С образуются прочные крупнопористые гели, представляющие со­бой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахари­дов. В процессе образования геля индивидуальные полисаха-ридные цепи образуют двойные спирали, которые далее агре­гируют с образованием «узлов*. При температуре около Ю0°С гель агарозы плавится, поэтому в отличие от сефадексов его нельзя автоклавировать. Высушивание агарозы приводит к необ­ратимой деструкции геля, поэтому его необходимо кранкть в виде водной суспензии.

Гели на основе агарозы производятся фирмами «Pharmacia* (Швеция) и «Bio-Rad Labs» (США) и выпускаются под назва­ниям к «сефароза» и «биогель А» соответственно (табл. 3), а также «LKB» (Швеция) и «IBF* (Франция) — под названием «ультрогель А». При производстве сефарозы агароза подверга­ется специальной обработке, в частности, из нее удаляются заряженные полисахариды- Различают 3 типа сефароды и 6 ти­пов биогеля А в зависимости от концентрации агарозы (табл. 3).

Дли придания большей химической и термической стабиль­ности препараты сефарозы обрабатывают 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочных условиях, В результате такой обработки по­лучается поперечное шитый гель агарозы — сефароза CL (препа­рат фирмы «Pharmacia»),

Агар выделяют из клеточных мембран некоторых красных морских водорослей. Точный состав ею не известен Однако установлено, что он содержит» по крайней мере, два полисаха-

U

Таблица 3. Агароэа и некоторые ее производные

Функциональная группа		Название и марка	Концентра	Фнрыа
(заместитель по ОН-группе)			ц»я яга розы.
_		С-ефароэа 6Б	6	«Pharmacia»
				(Швеции)
—		Сефароза 4В	4	То же
I		Ссфароэа 2В	2	-*-
+		ДЭАЭ-сефароза	6	■ д^
		CL-6B
-ОСНаСООН		КМ—«ефароза CL-6B	6	—*—
—OCN		Бромциаисефароэа	4	_,
		4В
__ОС Н2—С Н—CHs-^O—		Октнлсефароэа	4	—1—
|		CL-4B
ОН
—(CHsJt—СНэ
—ОСНг—СНОН—СНа—О—		Феннл сефароза	4	—*—
-О		CL-4B
		Биогель А-0,5	10	«Bio-Rad
■				Labs» (США)
		Биогель А-1,5	8	—i—
		Бногель А-5	6	—3
		Бногель А-15	4	—»—
		Биогель А-50	2	—и—
		Биогель А-150	1	—*—
—O(CH2)sN(C2H5)2		ДЭАЭ-бногель А	—	—>—
		Активированная	4	<Pharmada>
				(Швеция)
—NH—(СНЙ) в—СОО—		СН—^сефйроза 4В Эпокснактнниро-	6
с/ —О—СН£СН—СНа—				То же
й		наиная сефарояа, 6В
—О (СНа) 4—О^СНа—
~^wm^j FT"""~*Vj -Fli

рнда: а га розу и агаропектин, Г ел к агара образуются аналогично агарозным при охлаждении горячего водного раствора до темпе­ратуры 38^СС. После высушивания гель агара превращается в прозрачную пленку, что позволяет использовать для изучения иммобилизованного в геле фермента оптические методы иссле­дования. К преимуществам агара следует отнести его низкую стоимость и нетоксичность. Отличительной особенностью этого носителя является способность формировать механически проч­ные гели даже при малых концентрациях в растворе.

Существенного улучшения свойств агара можно достичь сши­ванием эпихлоргидрином, диэпоксидными соединениями и т. д. Сшитый агар с регулируемой проницаемостью устойчив к на­греванию даже в щелочной среде, обладает высокой механиче­ской прочностью, а наличие большого количества оксигрупп поз­воляет легко модифицировать носитель. Это дало основания Дж. Порату (1976) считать агар почти идеальным носителем.

Альгиновые кислоты и их соли — это полисахариды бурых морских водорослей, состоящие из связанных р-1,4-связями остатков £>-маннуроноБОЙ кислоты:

сода

сош

п

Характерным свойством этих носителей является резкая за­висимость их растворимости от температуры и рН раствора. Так, альгиновые кислоты хорошо растворимы в горячей воде и плохо — в холодной. Алыинаты кальция обладают способ­ностью образовывать гели, поэтому они используются для иммо­билизации ферментов, клеток и органелл путем включения.

Гепарин представляет собой кислый полисахарид, содержа­щий чередующиеся звенья сульфатированной D-глюкуроноеой кислоты (или L-идуроновой) и сульфатиро ванного глюкоза мина (или N -ацетил -глюкоз амина):

OSO_aH

SOjH

Гепарин успешно применяется для получения водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в меди­цине для введения in vivo.

Белки. Использование белков в качестве носителей для нм-

16

мобилизации ферментов представляет интерес как для фунда­ментальных биохимических исследований, так и для практиче­ских целей» в частности для медицины. Этот интерес обусловлен тем, что многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с другими ее компонентами, & частности с липидами и белками. Поэтому полагают, что изучение поведения фермен­тов, иммобилизованных на белковых матрицах, позволит понять закономерности функционирования ферментов in vivo. С точки зрения практической значимости важными свойствами этих но­сителей являются высокая вместимость по отношению к фер­ментам и способность к биодеградации, а также возможность применения большинства из них (благодаря фибриллярной при­роде) в виде тонкой толщиной 80 мкм пленки (мембраны). Иммобилизацию на белковых носителях можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов.

К недостаткам белков как носителей медицинских препаратов для использования in vivo следует отнести высокую иммуно-генность (исключение составляют коллаген и фибрин).

Наиболее часто в качестве носителей применяются структур-ные белки, такие, как кератин, фиброин, коллаген; двигательные белки, в частности миозин, а также транспортные белки» напри­мер сывороточный альбумин.

Коллаген — фибриллярный белок группы склеропротеидов, основной компонент хрящей и сухожилии, обладаем высокой прочностью на разрыв. Особенностью этого белка является его высокая гидрофильность. Так, коллаген способен сорбировать от 1 до 5 г воды на 1 г белка, оставаясь в нерастворенном виде и сохраняя волокнистую структуру.

Коллаген — самый распространенный белок высших живот­ных. Легкость выделения коллагена из ряда биологических источников в сочетании со свойственным белкам наличием боль­шого числа групп — участков для связывания ферментов — при­влекает внимание к коллагену как к носителю для иммобилиза­ции ферментов. Коллаген используют и в виде модифици­рованных производных, придавая матрице широкий набор же­лаемых свойств. Так, блокированием амино- или карбоксильных групп можно изменить поверхностный заряд носителя и, соответ­ственно, гидрофильно — гидрофобный баланс; с помощью сшива­ющих агентов можно получить сжатую микроструктуру. Наибо­лее часто коллаген употребляется в азид ной форме. Для этого

карбоксильные группы коллагена®* этерифицируют с последу­ющей обработкой гидразином и азотистой кислотой:

@—CONHNHj

Продуктом переработки коллагена является желатина. Спо­соб ее получения весьма прост-— коллаген длительно обрабаты-

и аллее символом (и) обозначается носитапь

17

вается кипящей водой, в ходе чего гидролизуются некоторые ковалентные связи коллагена, В результате волокнистый, нераст­воримый коллаген превращается в растворимую смесь полинеп-тидов, называемую желатиной. Ценность этого носителя, облада­ющего гелевой структурой, заключается в его нетоксичности, легкости биодеградации, что позволяет применять желатину в фармацевтической и пищевой промышленностих.

Другим весьма распространенным фибриллярным белком группы склеропротеидов является кератин. Из кератина почти полностью состоят шерсть, волосы, роевые покровы, шелк и т. д. Как правило, кератин получают при переработке перьев (побоч­ный продукт .птицеперерабатывающих фабрик). Таким образом, кератин дешев и доступен в больших количествах, что немало­важно при использовании белков в качестве носителей.

Существуют две формы кератина — аир. Важной особен­ностью а-кератина является высокое содержанке цистеина, что представляет особый интерес для иммобилизации ферментов, со­держащих свободные SH-группы. р-Кератины, в частности фиб­роин (белок шелка и паутины), не содержат остатков цистеина, но в них очень высокое содержание глицина н аланнна, что необ­ходимо для образования вытянутой зигзагообразной конформа-ции полипептидной цепи. Для 0-конформации характерны меж­цепочечные водородные связи, в образовании которых участвуют все пептидные группы ji-кератина, что придает значительную устойчивость ^-структуре- Молекулярные отличия влияют на механические свойства. Так, нити fj-кератина обладают мяг­костью, гибкостью и нерастворимостью, однако уступают по прочности а-кератину. Выбор той или иной формы кератина для иммобилизации определяется конкретной задачей, стоящей перед исследователем .

При иммобилизации ферментов на носителях белковой при­роды нельзя не считаться с появлением диффузионных ограни­чений, определяемых гелевой структурой матрицы. Интересное решение проблемы диффузионных ограничений было найдено в случае использования в качестве носителей бел ков-глобул и но в хлопчатника. Так как комплекс фермент-носитель способен на­ходиться как в растворимой, так и в нерастворимой форме в зависимости от ионной силы раствора, то, изменяя последнюю, можно переводить комплекс в растворимую форму и облегчать, например, переработку нерастворимых в воде субстратов. Здесь укажем также, что подобным свойством обладают и некоторые синтетические полимеры, в частности полиэлектролиты и их комплексы, находящие все более широкое применение для иммо­билизации (ферментов.