§ 5. Пучи стабилизации ферментов,

не основанные на методе иммобилизации

Стабильные препараты иммобилизованных ферментов можно получать не только методами иммобилизации, но и другими путями. Иммобилизации подвергают ферменты, которые сами по себе обладают высокой стабильностью. Это прежде всего вы­сокостабильные биокатализа торы _t встречающиеся в природе. Для этого проводят поиск ферментов, обладающих высокой термостабильностью, как в мезофильных организмах, живущих при обычных температурах, так и в термофильных микроорга­низмах, которые самой природой приспособлены для существо-вания & высокотемпературном режиме. Кроме того, стабильные

_ш

ферментные препараты можно создавать искусственным путем, например методами химической модификации и белковой инже­нерии.

Химическая модификация белков. Со времени появления пер-вых сообщений об изменении стабильности ферментон в резуль тате модификации их функциональных групп химическими реа­гентами (середина 50-х годов) предпринимались неоднократные попытки стабилизировать ферменты методом химической моди­фикации. Анализируя эти попытки, удается выделить следующие основные молекулярные причины повышения стабильности бел­ков при их ковалентнон модификации:

1. в результате химической модификации белок может перей­ ти в отличную от нативной, например, более стабильную кон- формацию;

2. при химической модификации в белок зачастую вводятся новые функциональные группы, способные завязать дополни­ тельные стабилизирующие белок водородные связи или солевые мостики;

3. химическая модификация неполярными соединениями иногда усиливает в белках гидрофобные взаимодействия;

4. в результате модификации гидрофильными соединениями поверхностных гидрофобных областей в белке уменьшается пло­ щадь неблагоприятного контакта внешних неполярных остат­ ков с водой, что должно стйбилизонать белок.

Белковая инженерия. В начале 80-х годов в генетической инженерии был разработан метод, позволяющий получать из­мененные белки, отличающиеся от белков-прототипов заменой всего лишь одного аминокислотного остатка в строго заданном положении. Для биотехнологии этот метод» названный сайт-специфическим мутагенезом, или белковой инжеЕ*ерией^ интере­сен тем, что позволяет целе^ап^ГаНйеннсГ измшштЬ~структуру ферментов, а значит, их каталитические свойства и стабиль­ность.

Рассмотрим вкратце суть метода. Для белка с установлен­ной первичной и третичной структурой {известно более сотни таких белков) выбирают так называемый сайт (или центр) мутации, т. е. тот аминокислотный остаток, который подлежит замене. Поскольку in vivo мутация всегда осуществляется при биосинтезе путем замены отдельных нуклеотидов в гене, то не­обходимо перейти с языка структуры белка (аминокислотной последовательности) на язык генетического кода. Для этого, во-первых, ищут (или создают искусственным путем) кольцевую генетическую структуру — плазм иду, в состав которой входит

нужный белок. Во-вторых, химическим путем ^ длиной 12—18 основа-

ний. Его химический состав должен быть таков, чтобы соот­ветствовать небольшому участку первичной структуры выбран-ного* белка (длиной 4—6 аминокислотных остатков), включаю­щего сайт мутации. Однако в процессе химического синтеза

вместо нуклеотидного т^ипдехдд кодирующего ^нативную ами­нокислоту»» в состав нуклеотидной последовательности вводят другой триплет, который кодирует новый аминокислотный ос-"таток! ШГ"~бснове однонитевой плазм иды и синтезированного олигонуклеотида ферментативным путем создают гетеродуп-лексную двуннтевую плазм иду, в состав которой входит «му-тантный ген», несущий информацию о структуре белка с за­меной аминокислотного остатка в определенном положении. Далее путем генетико-инженерных манипуляций и клонирования гена получают клетки-трансформаторы» которые осуществляют биосинтез мутантного запрограммированного исследователем белка.

Использование метода белковой инженерии уже дало пер­вые успехи в стабилизации ферментов. Оценивая перспективы метода, следует помнить, что он является и в течение некоторого времени будет оставаться довольно дорогостоящим- Поэтому наиболее эффективным будет его использование в случае тех ферментов» которые, во-первых, сами достаточно дорого стоят, и, во-вторых, инактивация которых связана с химической мо­дификацией какой-то «ключевой» группы, существенной для инактивации белка (например, окислением SH-группы вблизи активного центра или дезамидированием остатков аспара-гина).

_Глава

_{РЕГ0НЕРАЦ/1Я}

КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ФЕРШНТАМИ

Системы с иммобилизованными ферментами имеют относи­тельно высокую стоимость, поэтому крайне желательно добиться многократного их использования. Иными словами, возникает проблема регенерации систем с иммобилизованными фермен­тами или, по крайней мере, их отдельных, наиболее дорого­стоящих компонентов- К основным компонентам таких систем относятся носители, ферменты и кофакторы. Как правило, не возникает необходимости регенерировать носитель, так как ис­пользуемые в промышленности носители либо дешевы, либо ста­бильны. В то же время достаточно остро стоит вопрос реге­нерации ферментов и кофакторов.