§ 4. Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий денатурации и диссоциации матнвных белков

Как уже отмечалось, практически любой инактивационный процесс начинается с обратимой стадии [N^TD на схеме (1)]. Ее молекулярный механизм сводится либо к обратимому конфор-мацнонному изменению (обратимая денатурация), либо, в случае олигомерных белков, к обратимой диссоциации на субъединицы. В этом случае стабилизация ферментов состоит в том, чтобы подавить первую стадию.

На основе подобных представлений разработан ряд общих принципов, следуя которым можно в сотни и тысячи раз замед­лить необратимую инактивацию большого числа различающихся по структуре и функции ферментов. В результате стало возмож­ным проводить целенаправленный поиск конкретных путей стаби­лизации как мономерных белков, так и ферментов с четвертич­ной структурой, используемых в биотехнологии.

Наибольшие успехи в стабилизации ферментов связаны с применением метода иммобилизации. В общем случае можно указать по крайней мере три причины изменения стабильности в результате иммобилизации: 1) изменение конформации им­мобилизованного фермента по сравнению с нативной структурой; 2) изменение микроокружения ферментной молекулы; 3) ужест-ченне нативной конформации белковой глобулы. Первые два фактора, по-видимому, нельзя положить в основу разработки общих методов стабилизации ферментов. Дело в том_т что вопрос о связи стабильности белков с изменением их конформации и микроокружения является малоизученным. Более того, такая связь (даже если ее удастся установить) индивидуальна для каждого фермента. Поэтому для целенаправленной стабилиза­ции ферментов гораздо более перспективным представляется третий путь — ужестчение (закрепление) нативной конформации фермента с целью воспрепятствовать ее разворачиванию. Сле­дует отметить, что этот подход (увеличение жесткости белков) широко используется природой при создании стабильных белков термофильных микроорганизмов, живущих при повышенных температурах (50°С и выше).

Многоточечное не ко валентное взаимодействие фермента с носителем. В принципе белковые молекулы могут связываться с теми носителями, на поверхности которых имеются заряжен­ные, гидрофобные, полярные группы, за счет относительно сла­бых электростатических и гидрофобных взаимодействий, водо­родных связей. Однако, поскольку эти связи слабые, они прак тически не обрузуются в разбавленных растворах полимерных носителей. Дело в том, что большие потери энтропии, происходя­щие при образовании комплекса белок — носитель вследствие «за­мораживания» поступательного и вращательного движения моле-

128

кул белка» не могут быть скомпенсированы за счет энергии образования слабых нековалентных взаимодействий.

Ситуация существенно изменяется при включении ферментов в концентрированные полимерные гели. Здесь в силу стерических препятствий, вносимых частой пространственной сеткой полимера, поступательное и, возможно, вращательное движение белковых молекул существенно заторможено. В результате в таких систе­мах образование комплекса белок — матрица становится термо­динамически гораздо более выгодным, поскольку здесь уже не требуется затрат свободной энергии для погашения потерь посту­пательной и вращательной энтропии ферментной глобулы при ее сорбции на полимерной матрице. Благодаря этому в концентриро­ванных полимерных гелях становится возможным многоточечное взаимодействие (за счет слабых нековалентных сил) фермента с носителем^ поскольку в таких гелнх^полимерные цепи со всех сторон окружают ферментную глобулу. Такое многоточечное взаимодействие в гелевых системах действительно имеет место; оно приводит к существенной стабилизации ферментов. Так, а-химотрипсин, иековалентно включенный в заряженный гель по-лиметакриловой кислоты, в Ю⁵ раз более термостабилен, чем натнвный фермент, если концентрация полимерных цепей в геле составляет 50%.

Говоря о практическом применении гелевых систем, необхо­димо отметить один их существенный недостаток. Частички геля склонны к набуханию в воде, что приводит к снижению концент­рации полимерных цепей в геле. В результате эффект стабили­зации включенного в гель фермента может уменьшаться и даже вовсе исчезать, поскольку, как обсуждалось, для реали аза ции многоточечного не ко валентно го взаимодействия фермента с носи­телем необходимо, чтобы гель был достаточно концентрирован­ным. Поэтому практическую ценность с точки зрения повышен­ной стабильности препарата биокатализатора в суспензии имеют только те системы, в которых молекулы фермента включены в «сильное шитые»» не набухающие в воде гелевые частицы.

Многоточечное ко валентное присоединение фермента к по­верхности носителя (рис. 24, а). Другой путь у жестчения струк­туры фермента заключается в его иммобилизации на носителе с образованием большого числа ковалентных связей. Для реали­зации многоточечного взаимодействия необходимо, чтобы разме­ры ферментной глобулы и поры носителя соответствовали друг другу. Если проводить иммобилизацию белка на произвольно взятом носителе, то такое соответствие можно получить лишь случайно, поскольку поверхность носителя и поверхность белка имеют свои индивидуальные рельефы, в общем случае не комп­лементарные друг другу.

Этого недостатка лишен сополимеризационный метод иммоби­лизации, позволяющий создать полимерный носитель, комплемен­тарный молекуле фермента. Фермент химически модифици­руют (например, по аминогруппам) аналогом мономера, т.е.

129

и р#агвкт

Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-лнэационных подходов к стабилизации ферментов

соединением, содержащим ненасыщенные связи (например, хло-рангидридом акриловой кислоты или акролеином). При после­дующей сополимеризации с мономером (например, с акрила-мидом кли метакрилатом натрия) белковая глобула формирует вокруг себя поверхность носителя, комплементарную собствен­ной, ковалентно к ней присоединяясь. Сополимеризационный ме­тод дает уникальную возможность получать препараты фермен­тов, пришитых различным числом ковалентных связей к поверх­ности носителя, за счет варьирования степени модификации на стадии обработки фермента аналогом мономера.

Ферменты, иммобилизованные по сополимеризационной мето­дике, обладают гораздо более высокой устойчивостью против инактивации при повышенных температурах, чем соответствую­щие нативные ферменты. Эффект стабилизации, определяемый как отношение констант скоростей необратимой инактивации нативного и иммобилизованного препаратов, возрастает с увели­чением числа связей между ферментом и носителем и достигает больших величин. Например, для а-химотрипсина, пришитого к носителю 15 связями, стабилизационный эффект составляет более 1000 раз. Такие ферментные препараты сохраняют ката­литическую активность при существенно более высоких темпе­ратурах. Так, например, оптимум эстеразной активности трип­сина, ковалентно вшитого в полиакриламндный гель 15 связями, наблюдается при температуре 75°С, что на 25° выше оптимума активности нативного фермента. Это указывает на резкое по­давление быстрых обратимых денатурационных процессов в иммобилизованном препарате.

Следует отметить, что эффект стабилизации для иммобили­зованного по сополимеризациониой методике фермента зависит только от числа ковалентных связей с носителем, но не зависит ни от плотности гелевого носителя (т.е. от концентрации поли­мера в геле), ни от степени его набухания. Более того, проводя сополимериза цнонную иммобилизацию в отсутствие бифункцио* нального сшивающего агента, удается получить водорастворимые

130

ферментные препараты, также обладающие повышенной термо­стабильностью.

Внутримолекулярное сшивание фермента бифункциональными реагентами (рис. 24,6). Модификация фгрмента бифункциональ­ными агентами в принципе может принести к наложению на белковую глобулу внутримолекулярных ковалентных сшивок. Следует ожидать, что сшивание увеличит конформацнонную жесткость белка и, следовательно, его стабильность. Этот подход (внутримолекулярное сшивание белка) активно используется в природе для увеличения стабильности белковых структур. К чис­лу «природных сшивок» относятся как ковалентные S—S-связи, так и нековалентные «солевые мостики», ионы Са^й+ и других металлов, связанные с молекулой белка, и т. п.

Успех или неудача при попытке повысить стабильность фер­мента обработкой бифункциональными реагентами в основном определяется соответствием длины реагента расстоянии") между возможными центрами пришивки на белковой глобуле. Очевидно, что для каждого конкретного белка существует оптимальный размер сшивающих агентов. Единственно надежный путь опре­деления размера подходящего реагента — эмпирический поиск. Для этого изучаемый фермент модифицируют соединениями гомологического ряда бифункциональных реагентов, например алифатических диаминов или имидоэфиров алифатических ди-карбоновых кислот, в условиях, когда не происходит межмоле­кулярного сшивания белковых молекул. Далее изучают зависи­мость стабилизационного эффекта от длины бифункционального реагента. Обычно такие зависимости имеют вид кривой с мак­симумом. Дело в том, что при модификации бифункциональным реагентом наряду с образованием «сшивок» происходит одното­чечная модификация функциональных групп белка. Соотношение этих двух процессов тем сильнее сдвинуто в сторону реакции сшивания, чем больше на поверхности белковой глобулы пар функциональных групп, расстояние между которыми примерно равно длине сшивающего агента. Именно в этом случае наблю­даются максимальные стабилизационные эффекты.

Следует отметить, что эмпирический характер поиска опти­мального сшивающего агента несколько снижает ценность мето­да внутримолекулярного сшивания белков для практических целей. Действительно, для каждого вновь взятого белка или при использовании нового гомологического ряда бифункциональных реагентов работу по подбору наилучшего сшивающего агента надо проводить заново.

Тем не менее метод сшивок весьма полезен, поскольку позво­ляет получать водорастворимые стабилизированные производные ферментов с относительно низкой молекулярной массой (срав­нимой с молекулярной массой самого фермента). Такие препа­раты предпочтительны в некоторых прикладных областях, в члетмоети в медицине

Механическое включение ферментов в «тесные» поры носите-

131

ля (рис, 24,в). Разворачиванию белковой глобулы можно также воспрепятствовать, если поместить молекулу фермента в ячейку носителя, не взаимодействующую с ней ни химически, ни сорб-ционно, но столь «тесную», чтобы развернутая конформация не могла образоваться по стерическим причинам. В этом случае натиннаэт кпнформапия белка могли бы поддерживаться чисто механическим путем.

Стабилизацию фермента в «тесных» ячейках методически проще всего осуществить включением белков в полимерные гели, например при проведении процесса полимеризации моно­меров в присутствии фермента. Известно (см. гл. 1), что попе-речно сшитые полимерные гели (полиакриламидный, полисаха-рндные и др.) имеют пористую структуру. В геле, как правило, наблюдается относительно узкое распределение пор по размерам; размер пор задается концентрацией полимерных цепей. Он тем меньше, чем выше концентрация полимера в геле. Поэтому, включая фермент в гели различной концентрации, можно реа­лизовать ситуацию, когда белковая глобула окажется «зажа­той» полимерными цепями носителя и благодаря этому «кле­точному эффекту» не сможет развернуться, В таких случаях достигаются существенные стабилизационные эффекты: вклю­ченные в гель ферменты в тысячи раз стабильнее своих на тивных (неиммобилизованных) предшественников, причем ста­билизация проявляется тем сильнее, чем выше концентрация полимера.

Практическое применение гелевых препаратов тормозится, однако, тем, что в водных растворах гидрофильные гели сильно набухают. При этом значительно уменьшается концентрация по­лимера в гелевой фазе и, следовательно, нарушается соответ­ствие размеров пор геля и белковой глобулы. Один из способов устранения этого нежелательного эффекта заключается в том, что при получении гелей увеличивают концентрацию сшиваю­щего агента; за счет этого макроструктура образовавшихся гелей получается более жесткой и они набухают в гораздо меньшей степени.