2 Cosh of -- I

.каж

Таким образом, роль внутриднффузионных ограннчений в кине­тике реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, сводится к увеличению кажущейся константы Мкхаэлнса.

При выводе уравнений для рассмотренных систем делалось допущение, что частицы носителя с иммобилизованным ферментом представляют собой плоские мембраны. Однако в общем случае форма частиц может быть иной — сферической, цилиндрической, неправильной. Решение задачи в случае частиц носителя произ­вольной формы приводит к следующему выражению для на блюда-106

1.0

80/

Рис. 17. Вид зависимости фактора эффектив­ности (F) ферментативной pea мши от al: а — параметр, определяемый кинетическими и диффузионными характеристиками системы с им-мобилизованным ферментом; (— толщина мем­браны

емои скорости фермента­ тивной реакции, контро­ лируемой диффузией: у_иай1 = ijt»_T где v — ско­ рость реакции в отсутст­ вие диффузионных огра­ ничений; tj — фактор эф- °'⁶ фективности, который за­ висит от параметра Ф_% называемого модулем Ти­ ле- Хотя конкретный вид функции ц {Ф) зависит от формы частицы и по­ рядка реакции по суб­ страту, но очень часто описывается кривой, ана­ логичной виду зависи­ мости F от Ы (рис. 17). Таким образом параметр

J, характеризующий внутреннюю диффузию в плоской мембра­не, является частным случаем модуля Тиле. Для оценки роли внутренней диффузии в конкретной системе с иммобилизованным ферментом в принципе необходимо вычислить модуль Тиле Ф к, ос­новываясь на рис. 17, сравнить соответствующее значение ц с еди­ницей.

Способы различия внутридиффузионных и внешнедиффузион-ных ограничений. Существует два основных экспериментальных критерия, по которым можно определить, протекает ли реакция, ка­тализируемая иммобилизованным ферментом, во внутридиффу-зиоином или внешнедиффузнонном режиме. Онн основаны на раз­личной чувствительности кинетических параметров ферментатив­ных процессов, контролируемых внешней и внутренней диффузией субстрата, к действию специфических лнгандов и температуры. Для внутриднффузионно-контролируемых реакций прн очень больших значениях а/, когда F <С 1, т. е. ферментативная реакция существенно замедлена диффузией, имеем /См, каж Э> [S]o- В этом случае для общей скорости ферментативной реакции, отнесенной к объему носителя, справедливо выражение

Видно, что скорость реакции пропорциональна квадратному корню из концентрации фермента и его активности (k_Kb1l). Эта ситуация существенно отличается от случая внешнедиффузионных ограни-чений, когда скорость реакции в диффузионной области не зависит от каталитических свойств фермента. В частности, ферментатив­ные реакции, контролируемые внутренней диффузией, «чувствуют» эффекты ингибирования, рН-завнсимость активности и т. п.

Как было отмечено выше, температурные зависимости реакций.

107

контролируемых внешнедиффузионными ограничениями, целиком определяются чувствительностью к температуре коэффициента диффузии D (энергии активации порядка 15—20 кДж/моль). Иная ситуация реализуется для процессов, контролируемых внут-ридиффузнонными ограничениями. Здесь кажущееся значение энергии активации зависит от температурного хода как кинетиче­ского ( /Л^т/Км.клж) и диффузионного параметров, так и коэффи­циента распределения Р субстрата между раствором и фазой носи­теля [уравнение (12)1 ^и> ^ка« правило, характеризуется более вы­сокими численными значениями (больше 40 кДж/моль).

Стерические ограничения в катализе иммобилизованными фер­ментами. Пространственная сетка матрицы, в которой иммоби­лизован фермент, может препятствовать продвижению молекул субстрата, например, в силу чисто механических причин. В резуль­тате активные центры части ферментных молекул оказываются недоступными для субстрата. Фактически это означает снижение концентрации активного фермента и приводит к уменьшению наблюдаемой скорости ферментативной реакции. Следовательно, хотя истинные каталитические параметры и не изменились, фер­мент не может полностью проявить свою потенциальную актив­ность.

Уменьшение каталитической активности фермента за счет сте-рическнх факторов проявляется особенно часто в случае высоко­молекулярных субстратов. Поэтому при создании биокатализато­ров» действующих на белки» нуклеиновые кислоты и другие природ­ные биополимеры, предпочтительнее иммобилизовать ферменты на водорастворимых носителях с небольшой молекулярной массой. Стерическне ограничения иногда удается уменьшить или даже полностью устранить путем деградации носителей под действием химических реагентов (мягкой обработкой окислителями, кисло­тами н т. п.) или специальными ферментами {декстраназой, цел-люлазой н др.). При этом важно, чтобы такая обработка не затро­нула первичную структуру и ие нарушила пространственную орга­низацию ферментов, пришитых к носителю.

рН-Эффекты в катализе иммобилизованными ферментами. Из ферментативной кинетики хорошо известно, что скорости реак­ций с участием ферментов в гомогенном растворе сильно зависят от значения рН. Это обусловлено тем, что в катализе участвуют функ­циональные группы белка, способные протонироваться или депро-тонироваться в зависимости от рН в растворе, а реакционноспо-собной является» как правило, только одна из форм.

В принципе рН-эффекты в катализе иммобилизованными фер­ментами описываются теми же закономерностями, которые были рассмотрены при анализе распределения субстрата. Однако ионы Н"¹" и ОН"~ относятся к числу наиболее обших эффекторов ферментативной активности, поэтому вопрос о влиянии их рас­пределения и диффузии на кинетику действия гетерогенных биокатализаторов необходимо рассмотреть отдельно.