§ 5. Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем

Иммобилизация на предварительно модифицированных но­сителях. Предварительная модификация носителя во многих случаях позволяет существенно повысить прочность связывания адсорбционно-иммобилнзонанного фермента. Следует подчерк­нуть, что помимо увеличения эффективности сорбции модифика­ция носителя нередко обеспечивает также улучшение каталитиче­ских свойств иммобилизованного фермента благодаря созданию для его молекул благоприятного микроокружения. Более того, без предварительной модификации носителя иногда вообще не удается сохранить каталитическую активность фермента при ад­сорбционной иммобилизации. Например, если фермент обладает низкой стабильностью в кислой области рН, то при его адсорб­ции на силикагеле может произойти потеря каталитической активности, поскольку поверхность этого носителя имеет кислый характер (рН —4), Для предотвращения инактивации фермента силикагель перед проведением иммобилизации необходимо вы­держать некоторое время в буферном растворе с таким значе­нием рН, которое является оптимальным для данного фермента. Аналогичная проблема часто возникает при адсорбционной им­мобилизации ферментов, которым для нормального функциони­рования необходимо присутствие в активном центре иона ме-

51

талла. Дело в том, что большинство носителей способны селек­тивно и прочно сорбировать ионы металлов, поэтому при ад­сорбционной иммобилизации металлозависимых ферментов мо­жет происходить частичная или полная потеря каталитической активности, обусловленная выходом иона металла из активного центра фермента и его связыванием на поверхности носителя, Это нежелательное явление можно устранить, если до прове­дения иммобилизации обработать носитель избытком раствора, содержащего ионы соответствующего металла, и тем самым на­сытить центры сорбции ионов металла на носителе.

Предварительная обработка носителя ионами металлов при­меняется также и для повышения прочности связывания ад-сорбционно-иммобилиэованных ферментов. Увеличение эффек­тивности сорбции достигается в этом случае за счет образо вакия комплекса белка с ионами переходных металлов (таких, как Ti, Sn, Zr, V_t Fe)_t которые,в свою очередь, прочно связаны с поверхностью носителя (рис. 4,а). Иными словами, ион метал­ла выступает в роли мостика, соединяющего молекулу фермента с носителем. Этот метод дает хорошие результаты при иммоби­лизации различных ферментов на таких носителях, как, на­пример, целлюлоза, найлон, стекло, фильтровальная бумага и т. д.

Способ, основанный на обработке носителя ионами металлов, может служить хорошей иллк>страцией одного из главных прин­ципов, лежащих в основе применения модифицированных носи­телей: модификация должна придавать носителю такие свойства, благодаря которым усиливается его способность к связыванию ферм с нтон.

Один из возможных путей достижения этой цели состоит, помимо использования ионов металлов, в обработке носителя веществами, молекулы которых содержат большое число функ­циональных групп, способных взаимодействовать с группами на поверхности ферментной глобулы за счет электростатических и водородных связен (рис. 4,6). Например, полимеризация на поверхности силохрома акриловой кислоты, винилацетата и т. п. с последующей химической модификацией полимера приводит к образованию носителя, характеризующегося высокой поверхност­ной концентрацией функциональных групп (гндроксильных, амииоалкильных, аминоарильных и гидразидных). В качестве модификатора часто используется также альбумин, который на­носится на носитель путем адсорбции, а затем подвергается денатурации нагреванием. Слой денатурированного альбумина образует на поверх ногти носителя «мягкую» подложку с боль­шим числом функциональных групп, способную прочно связы­вать молекулы фермента, одновременно обеспечивая для них благоприятное микроокружение. В результате во многих случаях при обработке альбумином удается добиться повышения эффек­тивности сорбции и улучшения каталитических характеристик иммобилизованного фермента.

52

заряженная

гидрофобная нотка

гидрофильный фврмвкт

гидрофобный ферменг

Рис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предвари­тельно модифицированных носителях

Для повышения эффективности сорбции может быть также использована модификация носителя гидрофобными соединения­ми. Связывание фермента с такими носителями обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий между модификатором и неполярными участками на поверхности белковой глобулы. При этом способе иммобилизации применяются те же носители, которые используются при гидрофобной хроматографии белков. В первую очередь к ним относятся различные а га розы _т ковал ент-ио модифицированные гидрофобными группами (алкильными, феннльными и т. п.). На конце такой гидрофобной «ножки» мо жег присутствовать также и заряженная группа_t благодаря чему обеспечивается взаимодействие с ферментом одновременно за счет электростатических и гидрофобных сил (рис. 4, в). При таком «многоточечном» связывании сорбция многих ферментов протекает практически необратимо. Эффект много­точечного связывания достигается также при использовании полисахаридных носителей, модифицированных танином — при­родным дубящим веществом, содержащим большое число фе-нольных групп. Танин может быть либо адсорбирован на носи­теле, либо связан с ним химически. Удерживание фермента на

поверхности обработанных танином носителей обеспечивается за счет электростатических, водородных в гидрофобных взаимодей­ствий.

Эффективность сорбции фермента может быть увеличена также при использовании носителей, предварительно модифици­рованных путем адсорбции монослоя липида (см. гл. 1). Ис­пользуя носители с той или иной ориентацией липидных моле­кул в адсорбированном монослое, можно добиться максималь­ной эффективности сорбции как гидрофильных (рис. 4,г), так и гидрофобных (рис. 4_fd) ферментов.

Модификацию носителя иногда проводят путем ковалентной пришивки к его поверхности молекул, ннляющихся- специфиче­скими лигандами иммобилизуемого фермента. Иммобилизация с использованием таких носителей достигается за счет образо­вания прочного нековалентного комплекса между ферментом и связанным с носителем лнгандом. Этот метод иммобилизации, получивший название аффинной сорбции, широко используется в лабораторной практике, например, для избирательного выде­ления ферментов из сложных смесей (аффинная хроматогра­фия).

Рис. 5. Адсорбционная иммобилизация

предварительно модифицирован и ы\

ферментов

Иммобилизация предварительно модифицированных фермен­тов. При адсорбционной иммобилизации на ионообменниках час­то возникают затруднения, связанные с тем, что для многих ферментов изоэлектрическая точка и рН-оптимум каталитиче­ской активности очень близки. Поэтому прочная сорбция наб­людается лишь в областях рН, далеких от изоэлектри-ческой точки, где каталити­ческая активность мала. Что­бы преодолеть это препят­ствие, был разработан ме­тод иммобилизации фер­ментов, предварительно мо­дифицированных введением ионогенных групп {полн-кислоты, карбокснметилцел­люлоза , остатки янтарной кислоты и т.п,). Например, при модификации а-химо-трипсина хлортриазинолым красителем (активным ярко-оранжевым КХ) изоэлек­трическая гочка фермента сдвигается в щелочную об­ласть. В результате этого модифицированный а-хнмо-трипсин достаточно хорошо сорбируется на многих ионо-обменннках с сохранением

54

каталитической активности. Другой пример - модификация аосимотрипсина растворимой карбоксн метил целлюлозой* в ре­зультате которой он приобретает способность прочно свя­зываться с ДЭАЭ-целлюлоэой и ДЭАЭ-сефадексом при ней­тральных значениях рН. Принцип, лежащий в основе этого способа иммобилизации» иллюстрируется схематическим рис. 5, а.

При иммобилизации на гидрофобных носителях эффектив­ность связывания можно увеличить, если промодифицировать молекулу фермента гидрофобными группами (рис. 5,6).

Другие способы увеличения прочности связывания фермента с носителем. Для предотвращения смывания иммобилизованного фермента с носителя часто используют прием, при котором слой адсорбированного фермента обрабатывают бифункциональным сшивающим агентом. В результате на поверхности носителя образуется как бы сплошная пленка из сшитых между собой молекул фермента. В качестве сшивающего агента чаще всего применяется глутаровый альдегид.

Оригинальный способ, позволяющий существенно повысить количество сорбционно иммобилизованного фермента был предложен К-Мартине ком с сотр. (1976), которые использо­вали для иммобилизации найлоновые волокна, подвергнутые частичной химической деструкции. Волокна помещают в раствор фермента (рис. 6, а) и подвергают механическому растяжению,

растягивающее усилие

Рнс. 6. Иммобилизаций ферментов путем механического за­хвата в порах иэнлоновой нити при ее растяжении

55

в результате чего размер пор на их поверхности увеличивается. Молекулы фермента получают благодаря этому возможность проникнуть внутрь пор к там адсорбироваться (рис. 6, б). Через некоторое время растягивающее усилие снимают, волокно сжимается и размер пор возвращается к исходному значению. При этом молекулы фермента, оказавшиеся внутри пор при растяжении волокна, уже не могут покинуть их. Иными словами, происходит механический захват молекул фермента порами носителя (рис. 6, е).

Сравнительно новым методом является электроудерживание, при котором иммобилизация ферментов, осуществляется под действием электрического поля на коллекторах, отделенных от электродов мембранами. 8 качестве коллектора могут исполь­зоваться силикагель, ноиообменники, минералы н другие носи­тели. Фермент удерживается на коллекторе за счет электро­статических и диполь-дипольных взаимодействий между поляри­зованными частицами коллектора и молекулами белка. Недостаток этого метода состоит в том, что система должна постоянно находиться под напряжением, поскольку в противном случае фермент будет смываться с носителя.