§ 1. Кинетические параметры ферментативных реакций

В простейшем случае скорость (v) катализируемой фермен­том реакцни анализируется в рамках уравнения Михаэлиса— Ментен;

97

где [£]о и [S]o — концентрация фермента и субстрата в системе соответственно; к^т — каталитическая конгтантз ферментатив­ной реакции; /С_Млаж — определяемое эффективное (кажущееся) значение константы Михаэлиса.

Параметр Лм_язж служит характеристикой сродства фермента к субстрату н_т следовательно, является мерой той концентрации субстрата, которая необходима для насыщения фермента. При катализе иммобилизованными ферментами концентрация суб­страта вблизи фермента (локальная) может отличаться от кон­центрации субстрата во всем объеме системы. В этом случае на­блюдаемая на опыте Кп.каж должна зависеть от распределения субстрата-между свободным раствором и носителем, где сосре­доточен фермент. Что касается параметра ^„_ат1 то он характе­ризует реакционную способность уже образовавшегося фер­мент—субстратного комплекса, поэтому не зависит от распреде­ления субстрата в системе, а определяется состоянием, в первую очередь, конформици^й самого фермента.

Каталитические параметры ферментативной реакции (ft_raT и Км.каж) могут зависеть от наличия в реакционной системе раз* личных эффекторов, таких, как ингибиторы и активаторы, ионы водорода и т. п. В таких случаях необходимо учитывать рас­пределение также этих эффекторов между раствором и фермент-содержащей матрицей.

Таким образом, все кинетические эффекты, наблюдаемые при катализе иммобилизованными ферментами, можно разделить на две группы. К первой из них относятся эффекты, связанные с влиянием иммобилизации на состояние (конформацию) фермен­та, а ко второй — эффекты, обусловленные распределением реа­гентов в системе.

§ 2. Влияние иммобилизации на состояние фермента

Информационные свойства иммобилизованных ферментов. При иммобилизации существует опасность, что белок присоеди­нится к носителю в конформацни, отличной от нативной. В этом случае каталитическая активность фермента может существенно измениться или вообще исчезнуть.

Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные из­менения при иммобилизации, решается исследованием структург>1 иммобилизован мы к ферментов физическими методами. Для этой цели с успехом использовали оптические методы (спектрофото-метрическии, флуоресцентный), метол спиновых меток и др. Анализируя данные этих исследований, можно сделать следую­щие выводы.

1. В результате иммобилизации пространственная структура фермента может либо существенно измениться, либо изме­ниться незначительно, либо остаться неизменной (что наблюда­ется чаще всего).

2. В тех случаях, когда конформация нативного и иммобилизо-

98

ванного ферментов различается, это обусловлено одной из трех причин. Во-перных, конформационпые различия могут быть обусловлены химической модификацией каких-либо важных д^я структуры функциональных групп белка и не связаны с самим процессом иммобилизации фермента (т. е. его присоединением к носителю). Чтобы устранить действие этого фактора, необхо­димо выбрать соответствующий метод иммобилизации не затра­гивающий этих функциональных групп в белке. Кроме того» часто фермент удается защитить от инактивации на стадии иммобилизации простым добавлением субстрата или другого специфического л и ганда в насыщающей концентрации, что поз­воляет получать препараты с более высокой удельной каталити­ческой активностью (т, е. активностью» отнесенной к I r носи-теля}-

Во-вторых, причиной искажения структуры фермента могут быть неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные, водородные связи) между ферментом и носителем, приводящие к денатурации. Чтобы избежать этих взаимодей­ствий, иногда достаточно заменить носитель на инертный по отношению к белку. Такой инертностью обычно обладают поли-сахаридные носители, пол и акрил амид и некоторые другие. Если замена носителя по какой-либо причине нежелательна, то исполь­зуют следующий методический прием: отдаляют белковые моле­кулы от поверхности носителя за счет увеличения длины «ножки» (сшивающего агента). При этом, как правило, удается ослабить неблагоприятное для фермента воздействие носителя.

И наконец, третьей возможной причиной различия структур нативного и иммобилизованного ферментов может быть большое число связей между ферментом и носителем.

3, В принципе может реализоваться такая ситуация, когда в результате иммобилизации конформация фермента практически не изменяется, но нарушается динамика конформационных изменений в белке. Так, у белков, связанных с носителями, могут замедляться необходимые для катализа кенформационные переходы, уменьшаться число конформационных стадий и глубина их протекания. Причиной этого являются неспецифиче­ские взаимодействия функциональных групп белка с носителем. Чтобы избежать их, необходимо, как показывает практика, про­водить иммобилизацию на инертных носителях.

Фиксация «напряженных» состояний фермента. Иногда исследователи целенаправленно стремятся «закрепить» с по­мощью иммобилизации конформацию фермента, отличающуюся от нативной. Это, в частности, оказывается важным для детек­ции конформационных изменений в ферментах, индуцированных субстратами, кофакторами и другими специфическими ли ган­да ми,

: Рассмотрим» как это делается (рис. Н). Комплекс фермента с субстратом или другим специфическим лигандом_t образующий­ся в присутствии насыщающих концентраций этого лиганда,

99

E-S

Рис, 14, Схематическое изображение фиксации с помощью иммо­билизации «напряженной» конформации бедна,

сшивают бифунциональными агентами (стадия а на рис. 14) или присоединяют к предварительно активированному носителю (стадия б на рис. 14). После удаления лнгаида фермент оста­ется зафиксированным в «напряженной» конформации.

Как показали многочисленные исследования, «замороженные» конформации фермента могут отличаться от обычных, ненапря­женных состояний, реализуемых в тех случаях, когда иммоби­лизацию проводят в отсутствие специфических лигандов, ло це­лому ряду свойств: стабильности, доступности к действию моди­фицирующих агентов» сродству к субстрату и специфическим лигандам, а также каталитическим свойствам. Этот фактор необходимо учитывать, поскольку иммобилизацию фермента иногда рекомендуют проводить в присутствии специфических лнгандов с целью большей сохранности ферментативной ак­тивности.