§ 1. Воздействия и вещества, вызывающие инактивацию ферментов

Все воздействия, приводящие к инактивации ферментов, иногда условно подразделяют на физические и химические. К физическим относят нагревание или переохлаждение, облуче­ние (у- и рентгеновское излучение), ультразвук, сорбцию на

границах раздела фаз (типа вода - воздух или жидкость -жидкость). Химическая инактивация может быть вызвана, на­пример, щелочами к кислотами, поверхностно- активны ми веще­ствами, органическими растворителями, мочевиной и гуанидин-хлоридом, некоторыми окислителями (например, кислородом или пероксидом водорода) и восстановителями (например, тиолами, ионами металлов), а также некоторыми ферментами (например, протеазами или протеинкиназами). Однако попытка классифи­цировать инактивационные процессы, основываясь на условном разделении инактивирующих воздействий на физические и хими­ческие, практически ничего не дает для понимания сути этих процессов. Так, например, под действием физического фактора (нагревания) в молекуле белка часто происходят химические изменения; окисление функциональных групп, гидролиз пептид­ных связей, С другой стороны, действие таких химических дена-турантов, как мочевина или гуанндин хлорид, как правило, вы-зывает изменения только физического состояния белка (конфор-мационные перестройки), но не меняет его химическую струк­туру.

Более информативной, с точки зрения решения стабилиза­ционной задачи, является классификация инактивационных про­цессов по молекулярным механизмам.

§ 2. Молекулярные механизмы инактивации ферментов

Еще в 40-х - - начале 50-х годов сложились основные пред­ставления о механизмах инактивации. В наиболее общем случае инактивационный процесс можно представить в виде двухстадий-ной схемы:

N**D—I, (1)

где N, D и 1—соответственно нативная, обратимо денатури­рованная и необратимо инактнвированная формы белка*. Первая стадия на схеме (!) чаще всего представляет собой обратимое конформационное изменение; в случае олигомерных ферментов эта стадия состоит в обратимой диссоциации на субъ­единицы. Вслед за обратимыми процессами протекают необрати­мые стадии (D—Л)< Механизмы инактивации ферментов, как правило, классифицируют, исходя из природы процессов, про­исходящих именно на второй, необратимой стадии. Кратко рас­смотрим основные ииактивационные механизмы.

Агрегация. Очень часто при длительной инкубации в растнорс при повышенной температуре, при экстремальных значениях pH_t

* Термин <кнеобратимость» по ей ношению к инактивации имеет т\гт смысл, что после снятия инактиоанионншо воздействия (например, прн понижении температуры после 1фод<мжнтельн^го нагревания) фермент не втвращается h иатнвной каталитически активной информации N. Он остается в неактивной фор­ме 1 и в течение разумных времен наблюдения (часы. с\тки) ш- списобен само произвольно реактивироваться, т, е. перейти в форму N,"

12П

в присутствии химических денатурантов белки агрегируют. На возможность такой инактивации оказывает влияние целый ряд факторов: температура, рН и т. п.; однако решающим среди них является концентрация белка. Поскольку кинетиче­ский порядок уравнения, описывающего стадию агрегации, равен или даже больше двух, то, естественно, увеличение концентрации белка приводит к увеличению скорости агрегации и размеров образующихся агрегатов, а также ускорению инактивации в целом. По этому характерному признаку (сильная зависимость скорости инактивации от концентрации фермента в растворе) можно кинетически отличить агрегацию от мономолекулярных инактивационных механизмов.

Как правило, белковые агрегаты образуются за счет слабых нековалентных взаимодействий, таких, как гидрофобные взаимо­действия, водородные связи. Однако если в молекулах белков имеются SH-группы или дополнительно к ним еще S—8-связи_т то отдельные молекулы внутри агрегатов могут сшиваться ко-валентными дисульфидными мостиками. Размер и форма некова-лентных или ковалентпо-сшитых агрегатов могут изменяться в широких пределах вплоть до образования отдельной фазы — белковых осадков.

Изменение первичной структуры. Все химические процессы, приводящие к инактивации белков, можно подразделить на две группы. К первой относятся реакции разрыва пол и пептидной це-почки_т ко второй — химическая модификация отдельных функ­циональных групп белка.

Гидролиз пептидных связей, протеолиз и автолиз. Не катали­тическое растепление пептидных связей проходит в очень-жест­ких условиях. Так, полного расщепления полипептидной цепи на отдельные составляющие аминокислоты добиваются лишь пу­тем длительного (многочасового) кипячения раствора белка в концентрированной соляной кислоте. В несколько более «мягких» условиях, при нагревании белковых растворов при нейтральных или слабощелочных рН и температуре 80-100°С, гидролиз пеп­тидных связей либо проходит лишь незначительно, либо его вооб­ще не наблюдается. Из всех пептидных связей наиболее лабиль­ными к высокотемпературному гидролизу, как правило, оказыва­ются те, которые образованы остатками аспарагиновой кислоты.

Однако гидролиз пептидных связей в белках может происхо­дить и при нормальных условиях — комнатной температуре, нейтральных значениях рН. Это является результатом работы протеаз — ферментов, созданных природой для деградации дру­гих белков в мягких условиях. Поскольку в любых (даже высоко-очищенных) препаратах белков могут находиться протеазы в ка­честве сопутствующих примесей, при изучении механизмов инак­тивации необходимо учитывать и возможность протеолиза. ф Другим примером протеолитической инактивации может слу­жить бактериальное заражение реакторов, содержащих фер­менты. Случайно попавшие в реактор клетки микроорганизмов

121

секретируют протеазы, которые расщепляют молекулы фермента-биокатализатора, находящегося в растворе. Используя «осколки» протеолитической деградации в качестве питательной среды для роста, микроорганизмы размножаются; тем самым они, с одной стороны, «засоряют» реактор, с другой — уменьшают активность биокатализатора в растворе, т. е. инактивируют его.

Сами протеолитические ферменты способны расщеплять не только молекулы других белков, но и себе подобные- Этот про­цесс «саморасщепления» протеаз получил название автолиза. От большинства других инактивационных механизмов (за исклю­чением агрегации) автолиз можно отличить кинетически. Дело в том, что существенной стадией при автолизе является обра­зование комплекса между двумя молекулами п роте азы; эта би­молекулярная стадия часто определяет общую скорость инакти­вации. Поэтому, если при изменении начальной концентрации протеаяы наблюдается изменение скорости инактивации* то изучаемый ннактивационный процесс с большой вероятностью представляет собой автолиз.

Окисление функциональных групп фермента. При повышен­ных температурах некоторые функциональные группы в белках, и в первую очередь SH-группы цистеина и индольные фрагменты триптофана, окисляются. В результате окисления образуются модифицированные производные аминокислот; сульфоксисоеди-нения цистеина (SOH, SCW и т. д.), продукты раскрытия ин-дольного кольца триптофана и др. В некоторых ферментах сульф-гидрильные группы, входящие в состав активного центра, обла­дают повышенной реакционной способностью и окисляются даже при комнатной температуре.

Расщепление S—S-связей в белках. Расщепление может про­исходить либо в восстановительной среде (в присутствии тиолов, других восстановленных соединений серы, например ЫагЭОз, NaACbh либо в щелочной среде при повышенной температуре. В первом случае продуктом восстановления S—S-связи является ее тиольная форма {белок —SH) либо смешанный дисульфид тиольной формы белка с восстанавливающим реагентом (белок —S—S—R; белок —S—SOr и т. п,). При щелочном расщепле­нии S—S-связей пр!оисходит более сложная цепь химических реакций. Сначала цистин гидролизуется с образованием дегидро-аланина:

i—СНг—СН<^ + ОН ~ -* ЧСН-CH^S—S~ + СН_г = С

который, как нуклеофил, взаимодействует с аминогруппами остатков лизина, сульфгидрильными группами остатков цистеина, гуанидиниевыми группами остатков аргинина, образуя новые аминокислоты, соответственно, лизиноаланин, лантионин н орни-тниоаланин:

^{соонч хоон}

_г s ^a \