§10. Преимущества и недостатки иммобилизации ферментов путем включения в гель

Способ иммобилизации ферментов путем включения 8 поли­мерный гель отличается простотой применяемых методик, поз­воляет создавать иммобилизованные препараты любой геомет­рической конфигурации (сферические частицы, пленки н т. п.), обеспечивая при этом равномерное распределение би о катализа­тора в объеме носителя. Многие полимерные гели обладают высокой химической, механической и тепловой стойкостью, что дает возможность многократного использования иммобилизован­ных препаратов на их основе- Метод универсален, поскольку применим для иммобилизации практически любых ферментов» а также полиферментных систем, клеточных фрагментов и даже клеток. Важное преимущество метода состоит в том, что во многих случаях иммобилизация в геле приводит к значитель­ной стабилизации ферментов. Наконец, фермент, включенный в гель, надежно защищен от инактивации вследствие бактериаль­ного заражения, поскольку крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу.

Основным недостатком этого метода является то, что поли­мерная матрица создает значительные препятствия для диффу­зии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффектив­ность иммобилизованного препарата. Если в роли субстрата выступает высокомолекулярное соединение, то этот способ им­мобилизации вообще неприменим.

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛУПРОНИЦАЕМЫХ ОБОЛОЧЕК (МЕМБРАН |

Общий принцип, лежащий в основе этого способа иммоби­лизации, состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента (см. рис. 2, в). Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницае­мой мембраны и ее природой.

67

§ 11. Микрокапсулирование

Этот способ иммобилизации ферментов разработан Т. Чан-гом (1964). Суть его состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембра­ной) (рис. 9,о). В зависимости от условий получения размер мнкрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые — десятые доли микрометра при диаметре пор порядка нескольких нанометров. Существует два основных способа получения микро-капсул. В первом из них водный раствор фермента сначала диспергируется при энергичном перемешивании и диэтиловом эфире, содержащем ПАВ, которое выступает в роли эмульга­тора. К полученной эмульсии, не прекращая перемешивания, добавляют эфирный раствор полимера, обычно нитрата целлю­лозы. При соприкосновении с поверхностью эмульсионных ка­пель этот полимер, будучи нерастворимым в воде, образует тонкую оболочку-микрокапсулу. Готовые микрокапсулы отделяют центрифугированием или фильтрованием и про­мывают.

При втором способе микрокапсулирования образование мемб­раны на поверхности водных микрокапель достигается за счет реакции межфазной поликонденсации двух компонентов, один из которых растворен в водных каплях эмульсии, а другой — в объеме органической фазы. Наиболее распространенными яв­ляются полиамидные микрокапсулы, получаемые, например, пу­тем поликонденсации 1,6-гексаметилендиамина (водная фаза) и хло ран гидрида себаци новой кислоты (органическая фаза). Этот способ применим только для тех ферментов, которые не инак-тивируются при высоких значениях рН, существующих в водных растворах диамина.

Водный раствор фермента, использующийся для получения микрокапсул, должен содержать инертный белок (обычно ге­ моглобин) в концентрации около 10%, который обеспечивает в микрокапсулах необходимое внутреннее давление и стабилизиру­ ет фермент. Для повышения стабильности микронапсулирован- ного фермента его нередко подвергают также обработке глу- таровым альдегидом, приводящей к образованию внутри мнкрокапсул белковых полимеров. Кроме того» более высокой стабильности можно добиться, если перед микрокапсулированием фермент предварительно иммобилизовать путем адсорбции на носителе, включения в гель или другим способом. )

В некоторых случаях для иммобилизации применяются микрокапсулы, мембрана которых образована ковалентно сши­тыми между собой молекулами инертного белка. Такие микро­капсулы можно получить, если в методе с применением поликон­денсации в систему не вводить диамин. Тогда хлорангидрид дикзрбоновой кислоты (или другой используемый органораство-

«8

эмульсия вода/масло

s^

_т

а

Рис. 9. Иммобилизация ферментов с использованием полу-проницаемых оболочек (мембран):

2 эмульгирование; в-

волокна; г— включение в полые волокне проницаемым* стенкамн: д - включение в лниосомь,-обозначены молекулы фермента; символами S н IP - с н продукт ферментативной реакции соответственно

римый бифункциональный сшивающий агент) будет образовывать ковалентные сшивки между молекулами инертного белка, располагающимися на поверхности водной микрокапли,