§ 12. Двойное эмульгирование

При иммобилизации методом двойного эмульгирования (Т. Чаш, 1965) сначала готовят эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе полимера, точно так же, как было описано для случая получения микрокапсул первым спо­собом. Готовую эмульсию вновь диспергируют, на этот раз в воде. В результате получается водная эмульсиая из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие включенные капли водного раствора фермен­та (рис. 9,6). Через некоторое время органический раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с им­мобилизованным в них ферментом.

С. Мэй и Н. Ли (1972) предложили модификацию этого способа иммобилизации, в котором в качестве материала для образования мембраны вместо водонерастворимого отверждаю-щегосн полимера используются жидкие углеводороды с большой молекул ирной массой. Этот метод получил название иммобилиза­ции путем включения в жидкие мембраны,

§ 13. Включение в волокна

От микрокапсул и рованн я этот способ иммобилизации» пред­ложенный Д. Динелли (1972), отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом случае образуются сферические микрокапсулы» а во втором — нити. Суть состоит в том_т что Змульсию водного раствора фермента в органическом растворе волокнообразуюшего полимера (производные целлю­лозы, полнейнилхлорид, пол и-Л-метил глута мат) продавливают через фильеры в жидкость {например, толуол), вызывающую коагуляцию полимера. Полученные волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером около I мкм (рис. 9,е). Ферментсодержащне волокна обладают вы­сокой механической прочностью; например, из них можно изго­товить ткань, которая будет обладать ферментативной актив­ностью. Для дополнительного повышения механической проч­ности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную обо­лочку.

Для иммобилизации ферментов можно использовать также производимые промышленностью готовые полимерные полые волокна, которые применяют для очистки белков методом диа­лиза (рис. 9, г). Полые волокна изготавливают из природных или синтетических полимеров (целлюлоза, поли вин ил хлорид, полисульфон, полиакрил а мид); они имеют внешний и внутрен-

70

ний диаметр порядка нескольких сотен микрометров при толщи­не мембраны в несколько десятых микрометра. Для проведения ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует ра­створ фермента, погружают в сосуд с раствором субстрата,

диффундирующим через мембрану внутрь волокон.

§ 14. Включение в лилосомы

Впервые липосомы были использованы для включения фер­ментов Дж. Сесса и Дж. Вайсманом (1970). Значительный вклад в развитие этого направления принадлежит также Г. Гре-гориадису. Существует несколько способов получения липосом, содержащих включенный фермент (рис. 9, д). В одном из инх раствор липида (обычно лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме» и липид оста­ется на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор фермента, встряхивают до полного уда­ления пленки липида со стенок колбы и оставляют на некоторое время. В полученной таким образом дисперсии липида проис­ходит самопроизвольное образование (самосборка) мультила-меллярных липосом, содержащих включенный фермент. Во из­бежание окисления липида все операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.

В другом варианте метола раствор липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного раствора фер­мента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся ли пи дну ю пленку диспергируют в водном растворе. Недостаток этого спо­соба состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента.

Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае моноламеллярньн липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки, разделение проводят методом гель-фильтрации на колонке.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в липосомы, применяются главным образом в медицинских целях, а также при проведении фундаментальных исследований, поскольку такие системы близки к природным мембранам и их изучение может дать полезную информацию о ферментативных процессах в клет­ках.

Недавно был предложен новый способ иммобилизации фер ментов путем включения их в полимерные липосомы. Для полу­чения липосом в этом случае используются липиды, модифициро­ванные путем введения в их молекулу кратной связи (см. гл. 1), После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их подвергают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора. При этом происходит полимеризация мономерных молекул липи-

71

да с образованием ковалентно сшитой замкнутой лилидной бмслойной мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными.