Лиэинояланин

COOHv ^СООН

NH2 яянтионнн ^ NH?

С ООН. /СООН

Op нйтиноаланн н

Для того чтобы в белке произошло расщепление всех S—S-связей, требуются достаточно жесткие условия. Так, их восста­новление происходит при очень высоких концентрациях тиолов; в случае многих белков действие тиолов необходимо сочетать с одновременным разворачиванием белковой глобулы деватуран­тами, например концентрированными растворами мочевины или гуанидин хлорида. Полная щелочная деструкция S—S связей в белке происходит только в 0,1 — 1 М растворе щелочи при тем­пературах, близких к Ш0°С. Однако в белках, как правило, одна-две S—S-связи более реакционноспособны, чем остальные, и их деструкция (как восстановительная, так и щелочная) проходит с заметными скоростями в существенно менее жестких условиях: например, при температурах 60—80°С и слабощелочных значе­ниях рН. Поэтому, работая с ферментами в этих условиях» необ­ходимо учитывать возможность такого инактивационного меха­низма, как щелочное расщепление S—S-связей.

Следует также отметить, что иногда в литературе обсужда­ется механизм внутримолекулярного перераспределения S—S-связей. Его можно представить следующим образом: под дейст­вием гидроксид-ионов в белке расщепляются некоторые «иатнв-ные» S—S-связи и образуются SH-группы, Они, в свою очередь, могут атаковать другиё*5—S-связи в молекуле белка, что долж­но приводить к образованию новых «ненативяых» дисульфидных мостиков. Однако этот гипотетический инактиваьцгонный меха­низм представляется маловероятным и до сих пор не нашел экспериментальных подтверждений.

Химическая модификация участвующих в катализе SH-групп. в ферментах (например, входящих в состав активных центров). Подобная модификация часто приводит к инактивации фгрмен-тов. Один из примеров такой модификации — высокотемпера­турное окисление SH-rpynn был рассмотрен выше. В качестве другого примера можно привести «отравление* белков катиона­ми тяжелых металлов; Hg, Pb, Си и другими, следовые качества которых всегда присутствуют в воде. Механизм такой инактива­ции состоит в модификации SH-rpynn белков, проходящей до образования соответствующих меркаптндов.

123

Фосфорилирование белков in vivo. Этот процесс играет важ­ную регуляторную роль и иногда вызывает инактивацию фер-ментов. Происходящие при этом молекулярные процессы до кон­ца не ясны. По-видимому, в большинстве случаев потеря фер ментом активности вызвана не непосредственно ковалентным вв** дением в белок фосфатных групп {через остатки серина_т треонин;] тирозина), а происходящими вслед за этим конформационными изменениями. С этим механизмом инактивации также приходится считаться in vitro, поскольку фосфорилазы и фосфат азы (фер­менты, осуществляющие фосфорилирование) иногда содержатся в препаратах белков в качестве примесей.

«Самоубийственная» (суицидная) инактивация. Так принято называть группу механизмов, яри которых в ходе каталитиче­ского акта ферментативной реакции образуется реакционноспо-собная частица (чаще всего евободнорадикальной природы), способная химически модифицировать функциональную группу активного центра и тем самым нарушать активность фермента. В качестве примера приведем инактивацию проста гл а ндинсин-тетазы свободным радикалом пероксидиой природы, образую­щимся из арахидоновой кислоты под действием самого же фер­мента. Механизм «самоубийственной» инактивации обнаружен для ферментов различных классов (гидролаз, оксидоредуктаз). In vivo, по-видимому, он играет важную регулнторную роль, кон­тролируя в клетке содержание некоторых «ключевых» ферментов, обладающих особенно высокой каталитической активностью. Однако при практическом использовании ферментов для синтеза или_ модификации физиологически важных соединений с такой инактивацией необходимо бороться.

Радиационная инактивация ферментов (под действием рент­геновского и v излучения, УФ света и т. п.) является сложным многостадийным процессом. В нем выделяют фотофизические, фотохимические стадии (химические реакции под действием облучения в хромофорах — триптофане, цистенне и др.), а также темновые химические реакции. Возможность радиационной инак­тивации необходимо учитывать в тех случаях, когда иммобили­зация ферментов (например, при образовании гелей) иницииру­ется у излучением, УФ светом и др.

Рацемизация аминокислот в белках. Этот процесс проходит в «сверхжестких» условиях — при экстремальных значениях рН (ниже 2,0 и выше 12,0) и температуре выше 100°С Поскольку в настоящее время в таких условиях ферменты не применяют, то далее этот инактивационный механизм рассматриваться не будет.

Дезаминирование остатков аспарагина. Этот процесс проис­ходит в белках с заметными скоростями при высоких температу­рах (порядка 100°С) и слабокислых значениях рН (порядка 4,0—5,0). Такое изменение первичной структуры ферментов так же приводит к их инактивации.

Десорбция кофактора из активного центра фермента. Из­вестен большой класс ферментов, в состав активных центров

124

которых входят атомы металлов, металлосерные кластеры и дру­гие нековалелтпо 7ГёНт|Т51^ИЬ^гТ^у1шы^Цко^а1?Го^

некоторягх химических реагентов

например, хелатирующих), равновесном диализе и других про­цедурах равновесие между связанной с белком и свободной, не­связанной формами кофакторов может сдвигаться в сторону по­следней и кофакторы диссоциируют из активных центров фер­ментов в раствор. Если удаление кофактора из активного центра не сопровождалось последующими значительными изменениями конформации белка, то при добавлении избытка кофактора к де­натурированному ферменту он самопроизвольно реактивируется. Однако если диссоциация кофактора привела к большим конфор-мационным изменениям или вслед за ней произошла химиче­ская модификация существенных для структуры функцио­нальных групп, то инактивация фермента становится необра­тимой.

Диссоциация олигомерных белков на субъединицы. При дей­ствии многих денатурантов (мочевины, детергентов» кнелот, ка-греванни и т. п.) на олигомерные белки происходит их диссоциа­ция на отдельные субъединицы. Процесс этот, в принципе, обра­тимый. Однако, как правило, вслед за стадией диссоциации происходят другие процессы: конформационные изменения в от­дельных субъеднннцах, диссоциация кофакторов из активных центров, модификация (например, окисление) тех функциональ­ных групп, которые в олигомерном белке были экранированы от контакта с растворителем, агрегация субъединиц. Эти процессы часто являются необратимыми; в результате и сама диссоциа­ция приобретает кажущийся необратимый характер. В связи с этим необходимо отметить, что установление механизмов инактивации (кинетических и особенно молекулярных) олиго­мерных белков является одной из наиболее сложных задач в современ кой энзи мологин.

Сорбция белка на стенках реакционного сосуда. В общем случае поверхность реакционного сосуда не является абсолютно инертной по отношению к белку. Так, например, на поверхности стекла имеются некомпенсированные заряженные группы и потенциальные доноры и акцепторы водородных связей. Поэтому некоторые материалы, из которых изготовляют реакторы (в част­ности, стекло), способны сорбировать на своей поверхности фер­менты за счет образования слабых нековалентиых взаимодейст­вий. Это приводит к уменьшению концентрации фермента в растворе, т. е. к кажущейся инактивации.

Сорбционная способность поверхности ограничена и опреде­ляется число имеющихся на ней сорбционных центров. Поэтому при работе с концентрированными растворами белков практи­чески не чувствуется уменьшение ферментативной активности из раствора за счет сорбции. Однако «сорбционная инактивация» становится весьма заметной в разбавленных белковых растворах (концентрация 10~ ^е—10~^|0 моль/л).

Если в растворе произошло частичное или полное развора­чивание белковой молекулы, например, в результате нагревания, то на ее поверхиосги появляются новые дополнительные центры взаимодействия с поверхностью реакционного сосуда. За счет этого усиливается сорбциониая способность белков и, как следствие, «сорбционная инактивация» начинает чувствоваться в несколько более концентрированных растворах белка.

Инактивация в потоке. Этот тип инактивации особенно важен при проведении ферментативных процессов в проточных реакто­рах. По-видимому, это связано с тем, что в потоке происходит механическая деформация бслконых молекул.

Необратимые конфирмационные изменения (необратимая де­натурация)- Причиной необратимой инактивации могут быть так­же необратимо прошедшие в белковой макромолекуле конформа-циоиные изменения, т. е. необратимая денатурация. Механизм необратимой денатурации состоит в следующем. При денатура-цнонном воздействии, например при повышенной температуре, в белке разрушаются «правильные» неко&алентные взаимодей­ствия, которые поддерживают пат и вкую структуру, и образуются «иенативные» нековалентные взаимодействия, термодинамически выгодные при повышенной температуре. При охлаждении зги «неправильные» нековалентные взаимодействия сохраняются по чисто кинетическим причинам, поскольку молекулярная подвиж­ность существенно уменьшается при понижении температуры. Иными словами, в результате охлаждения белок оказывается «замороженным» в метастабильном «необратимо денатурирован­ном» состоянии и не может самопроизвольно ренатурироваться, т. е. перейти в натнвную конформацию.