Химические методы определения углеводов
Химические методы основаны на окислении свободной альдегидной или кетонной группы сахаров оксидами тяжелых металлов. В связи с тем, что оксиды металлов, окисляя сахар, сами восстанавливаются, сахара, способные восстанавливать окислители, называются редуцирующими. Это все моносахариды, также мальтоза, мальтотриоза и другие продукты гидролиза крахмала.
Скорость процесса окисления и состав продуктов реакции прежде всего зависят от активности окислителя, реакции среды и температуры. Решающее значение имеет рН среды. В кислой среды моносахариды сравнительно устойчивы, тогда как щелочная среда сама по себе вызывает далеко идущий распад молекулы сахара. Поэтому реакцию окисления сахаров проводят в щелочной среде.
Ионы тяжелых металлов ускоряют реакцию окисления. Как катализаторы они активируют кислород воздуха и переносят его на молекулу сахара, причем обратимо изменяется их валентность. Наиболее активные катализаторы – ионы меди, несколько слабее действуют ионы железа, еще слабее – ионы йода. В зависимости от активности окислителя и условий протекания реакции окисление альдоз и кетоз доходит до различных стадий.
Наиболее часто используют медьсодержащие растворы. Щелочной раствор меди готовят по способу, разработанному Фелингом. Жидкость восстанавливают все моносахариды и полисахариды, содержащие свободную карбонильную группу. Происходит фрагментация молекулы моносахарида, а соответствующий оксид металла, восстанавливаясь, образует закись. Определяя ее количество, можно по приложению 3 рассчитать количество имеющегося в растворе сахара.
Производственные среды обычно содержат смесь простых и сложных сахаридов. Так в сусле, кроме мальтозы, присутствует глюкоза, мальтоподобные сахара с 3 – 6 остатками молекул глюкозы и низкомолекулярные декстрины. Эти продукты гидролиза крахмала значительно различаются по молекулярной массе, но все имеют по одной свободной альдегидной группе. Следовательно, химическим анализом нельзя определить истинное содержание сахара в такой смеси без предварительного гидролиза сложных сахаров до моносахаридов.
Метод дает хорошо воспроизводимые результаты анализа только при строгом соблюдении условий проведения реакции окисления сахара.
В процессе затирания солода стремятся накопить мальтозу в количестве, достаточном для достижения концентрации алкоголя, требуемой стандартом для того или иного сорта пива. В зависимости от сорта пива содержание мальтозы колеблется от 65 до 80 % экстракта сусла. В сусле темных сортов пива ее содержится меньше (65...70 %), а в сусле светлых сортов — больше (75...80 %). Чаще всего определяют мальтозу методом Бертрана, который основан на окислении сахаров фелинговой жидкостью, которая представляет собой смесь двух растворов: сернокислой меди (I) и сегнетовой соли и едкого натра (II). Сущность метода заключается в следующем. Смешивая оба раствора Фелинга, получают осадок гидрата оксида меди, который, вступая во взаимодействие с сегнетовой солью, образует комплексное соединение меди. При кипячении с редуцирующими сахарами оно окисляет сахар, а медь при этом восстанавливается и выпадает в осадок в виде оксида меди красного цвета. Осадок отфильтровывают, промывают и растворяют в присутствии серной кислоты в растворе железо-аммонийных квасцов. Количество образовавшегося сульфата железа определяется титрованием перманганатом калия. Умножая объем, см3, перманганата калия, пошедшего на титрование, на его титр, определенный по меди, рассчитывают массу меди (мг) и по таблицам находят соответствующее содержание сахара. Количество углевода в пробе должно быть от 1 до 100 мг, оптимально 40...60.
Аппаратура и реактивы: конические колбы вместимостью 100 и 250 см3, пипетки, плитка электрическая, прибор для фильтрования, состоящий из колбы Бунзена и фильтра с пористой перегородкой, бюретка; жидкость Фелинга, состоящая из растворов Фелинга 1 и Фелинга II; раствор перманганата калия концентрацией 0,1 моль/дм3; железо-аммонийные квасцы; вода дистиллированная.
Проведение анализа. Вначале сусло разбавляют в 25 раз, для чего в мерную колбу на 250 см3 вносят 10 см3 сусла и содержимое доливают дистиллированной водой до метки. Метод Бертрана, по которому определяют содержание редуцирующих сахаров, базируется на свойстве веществ, имеющих карбонильную группу (>С=О) окисляться раствором Фелинга, состоящим из двух компонентов (I и II). При проведении анализа для окисления редуцирующих сахаров В коническую колбу на 200 – 250 см3 отмеряют по 20 см3 I и II растворов Фелинга, а затем 20 см3 пивного сусла, разбавленного в 25 раз. Содержимое колбы перемешивают, нагревают до кипения и кипятят точно 3 мин. Снимают колбу с огня, дают в течение 1...2 мин осесть осадку и надосадочную жидкость отфильтровывают на стеклянном фильтре со слоем асбеста толщиной 1 см в колбу Бунзена. Фильтруемую жидкость сливают на фильтр медленно по стеклянной палочке. Оставшийся в колбе осадок промывают 30...60 см3 горячей воды, которую тоже сливают в фильтр. Фильтр с осадком переносят в другую чистую колбу Бунзена. Фильтрование осадка (оксида меди) осуществляют при слабом разрежении. Не рекомендуется переносить осадок на фильтр, так как он образует слой, с трудом поддающийся последующему растворению.
Когда жидкость отфильтрована, к осадку прибавляют немного горячей воды и дают осесть, а жидкость сливают через фильтр. Следует следить за тем, чтобы осадок гемиоксида меди на фильтре и в колбе все время оставался покрытым жидкостью, иначе произойдет его окисление кислородом воздуха.
Затем осадок растворяют сульфатом железа или железоаммонийными квасцами. Для этого отмеривают 20 см3 этого реактива и приливают его в коническую колбу с осадком, в результате чего образуется раствор синевато-зеленого цвета. Полученный раствор переносят на фильтр для растворения оставшегося там осадка. Когда весь осадок на фильтре растворится, колбу Бунзена подключают к вакуум-насосу и раствор переводят с фильтра в колбу. Коническую колбу промывают 25...30 см3 холодной воды, которую добавляют к раствору в колбе Бунзена.
Промывание повторяют 5...6 раз. Затем жидкость в колбе титруют раствором перманганата калия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 с.
Спустя некоторое время розовая окраска исчезает, но это во внимание не принимается. Для титрования применяют 0,1 моль/дм3 раствор перманганата калия, 1 см3 которого соответствует 6,36 мг меди. Небольшое количество перманганата расходуется на окисление реактивов.
Параллельно с основным анализом проводят определение поправки на реактивы, для чего вместо 20 см3 раствора сусла используют 20 см3 дистиллированной воды. Поправку выражают в см3 раствора перманганата калия и вычитают из количества перманганата калия, пошедшего на титрование сусла в основном опыте. Полученную разность между этими числами умножают на титр перманганата калия по меди, который равен 10 (то есть 1 см3 раствора перманганата лия, израсходованного на титрование, соответствует 10 мг меди), и получают массу меди (в мг), восстановленной сахаром. При использовании 0,1 моль/дм3 раствора перманганата калия его титр по меди будет равен 6,36 мг меди.
По приложению 3, по числу см3 перманганата (с учетом поправки на реактивы) находят массу меди, а затем содержание сахара во взятом объеме исследуемого раствора или в 100 г продукта.
Кроме мальтозы в сусле имеются другие редуцирующие вещества (сахара и несахара), которые также восстанавливаются реактивом Фелинга. Поэтому результаты прямого определения редуцирующей способности сусла обозначают термином «сырая» мальтоза».
При принятом разбавлении содержание «сырой» мальтозы Х, г в 100 см3, вычисляют по уравнению
где а – масса мальтозы в 20 см3 разбавленного сусла, г.
Недостатки метода: нагревание на открытом огне на позволяет точно выдерживать температуру, следовательно, и продолжительность нагрева жидкости до кипения, что является одним из главных источников ошибок анализа, на отделение и растворение осадка оксида меди затрачивается много времени, опасность механических и химических потерь оксида меди обязывает к особой тщательности и требует определенных навыков
Достоинства метода – высокая точность результатов определения, при квалифицированном проведении анализа расхождение между двумя параллельными определениями не превышает 0,3 %. Метод разработан для большинства сахаров (гексоз и пентоз), что свидетельствует о его широком применении.
Пример: Для анализа взято 20 см3 пивного сусла, разбавленного в 25 раз. На его титрование израсходовали 8,85 см3 раствора перманганата калия, титр которого по меди равен 10 мг. Поправка на реактивы 0,1 см3. Масса меди, восстановленной сахарами, (8,85 – 0,1) · 10 = 87,5 мг. По приложению 3 интерполяцией находим, что 87,5 мг меди соответствует 80,3 мг мальтозы. Отсюда, содержание «сырой» мальтозы в г/100 см3 исходного сусла будет:
Х = (80,3 · 250 · 100) /(20 · 10 · 1000) = 10,04.
Метод, основанный на окислении альдоз йодом. Метод разработан Вильштеттером и Шудлем. В основу метода положена реакция окисления альдегидной группы сахаров в соответствующую одноосновную кислоту. Например, глюкоза окисляется в глюконовую кислоту по уравнению CH2OH(CHOH)4COH + J2 + 2NaOH = СН2ОН(СНОН)4СООН + + 2NaJ + H2O.
По приведенному уравнению процесс окисления сахаров протекает лишь в слабощелочной среде и при комнатной температуре. Щелочь добавляют в количестве, достаточном для нейтрализации образующейся кислоты, при этом щелочность среды не должна превышать рН = 9. Кетозы в этих условиях не окисляются, что позволяет определять глюкозу в присутствии фруктозы.
В сильнощелочной среде и при повышенной температуре альдозы окисляются в двухосновные кислоты, происходит также окисление кетоз, и результаты анализа значительно завышаются.
Количество окислившегося сахара определяют по разности между объемом раствора йода, взятого на окисление сахара, и объемом его избытка. Избыток йода определяют титрованием тиосульфатом натрия в кислой среде в присутствии крахмала.
Кислоту перед титрованием добавляют в строго определенном количестве, так как в сильно кислой среде образовавшиеся при окислении сахаров йодид и йодат натрия, вступая в реакцию с кислотой, выделяют свободный йод. Этот йод также оттитровывается тиосульфатом натрия, и результаты анализа сильно занижаются.
Крахмал добавляют в конце титрования, чтобы уменьшить адсорбцию на нем йода.
Содержание сахара в анализируемой пробе рассчитывают по уравнению реакции окисления, из которой видно, что на окисление одной молекулы сахара идет 2 атома йода. Для глюкозы эквивалент по йоду равен 180 : 2 = 90 г, а для мальтозы 342 : 2 = 171 г, где 180 и 342 – массы молекул сахаров. Следовательно, 1 см3 0,1 моль/дм3 раствора йода эквивалентен 0,009 г глюкозы и 0,0171 г мальтозы.
Для анализа готовят растворы, содержащие не больше 0,5 % сахара.
Метод широко используется для определения редуцирующих сахаров в сусле, активности амилолитических ферментов солода и грибных культур, при химическом определении крахмала в зерне и при других анализах. Ниже приводится методика определения мальтозы в пивном сусле.
Аппаратура и реактивы. Конические колбы вместимостью 200 см3; мерная колба вместимостью 250 см3; пипетки вместимостью 10, 25 и 50 см3; 0,1 моль/дм3 раствор йода; 0,1 моль/дм3 раствор тиосульфата натрия; 1 моль/дм3 раствор гидроксида натрия; 1 моль/дм3 раствор серной кислоты; раствор крахмала с массовой долей 1 % .
Проведение анализа. В мерную колбу вместимостью 250 см3 пипеткой отмеривают 10 см3 сусла, объем доводят до метки водой и перемешивают. 50 см3 раствора пипеткой вносят в коническую колбу, сюда же пипеткой (или из бюретки) добавляют 25 см3 0,1 моль/дм3 раствора йода и 3 см3 1 моль/дм3 раствора щелочи. Колбу закрывают пробкой, содержимое колбы перемешивают и ставят в темное место, чтобы избежать обратных фотохимических процессов. Через 15 – 20 мин к смеси добавляют 4,5 см3 1 моль/дм3 раствора серной кислоты и титруют 0,1 моль/дм3 раствором тиосульфата натрия до светло-желтой окраски. Затем прибавляют несколько капель раствора крахмала и медленно, при энергичном взбалтывании, по каплям приливают раствор тиосульфата натрия до исчезновения синей окраски крахмала.
Содержание мальтозы Х, г на 100 см3, вычисляют по формуле
Х = (а – б) · 0,0171 · 100 · n : в,
где а – объем 0,1 моль/дм3 раствора йода, взятый на реакцию окисления, см3; б – объем 0,1 моль/дм3 раствора тиосульфата натрия, пошедший на титрование избытка йода, см3; п – коэффициент разведения сусла; в – объем раствора сусла, взятый на реакцию окисления, см3.
Определение ведут в двух параллельных пробах, расхождение между которыми не должно превышать 0,1 – 0,2 см3 раствора йода.
Пример. На анализ взято 10 см3 сусла, объем доведен водой до 250 см3. На реакцию окисления взято 50 см3 раствора и 25 см3 0,1 моль/дм3 раствора йода. На титрование избытка йода пошло 13,5 см3 0,1 моль/дм3 раствора тиосульфата натрия. Содержание мальтозы в сусле
Х = (25 – 13,5) · 0,0171 · 100 · 25 : 50 = 9,83 г в 100 см3.
Йодометрический метод отличается высокой точностью, простотой и быстротой выполнения анализа, позволяет определять альдозы в присутствии кетоз.