Биуретовый метод определения белков (в модификации Дженнингса)

Метод основан на использовании известной цветной реакции на белки, содержащие группировку —СО—NH—, называемую пептидной связью. Он впервые использован для обнаружения производного мочевины – биурета.

Вещества, имеющие пептидные связи, в щелочном растворе CuSO₄ образуют окрашенные медно-натриевые (-калиевые) комплексные соединения, причем белки дают фиолетовое окрашивание, а пептоны и полипептиды – красно-фиолетовое. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству пептидных связей или концентрации белков. Измерив оптическую плотность окрашенного раствора, по калибровочной кривой находят содержание белков в навеске. Метод отличается высокой чувствительностью и позволяет вести определение при разведении белков 1:10000. При анализе зерновых культур относительная ошибка не превышает 5 %.

Определение аминного азота

Аминный азот – азот, входящий в свободные аминогруппы –NH₂ аминокислот и других продуктов гидролиза и других продуктов гидролиза белков. Его определяют при изучении активности протеолитических ферментов, состава форм азотистых соединений в сырье, полупродуктах и готовый продукции.

Расщепление белковых веществ в пивоварении

Все (высокомолекулярные) протеины за исключением небольшого количества, выпадают в осадок самое позднее при кипячении сусла. Поэтому в пиво попадают только продукты расщепления, которые, безусловно, необходимы для размножения дрожжей и быстрого сбраживания.

Ферментативное расщепление белковых веществ должно рассматриваться дифференцированно, так как:

при 45 – 50 ^оС в большей степени образуются низкомолекулярные продукты расщепления, особенно пептиды и аминокислоты;

при 60 – 70 ^оС в большей степени образуются высокомолекулярные продукты расщепления, которые считаются обеспечивающими пеностойкость.

Аминокислоты имеют большое значение для питания дрожжей. Дрожжи потребляют как минимум 10 – 14 мг α-аминного азота на 100 см³ сусла.

Так как аминокислота пролин как поставщик α-аминокислоты для дрожжей не используется, то в сусле должно содержаться α-аминного азота не менее 20 мг/100 см³. Если этого значения не удастся обеспечить, то это приводит к снижению скорости размножения дрожжей; к торможению процессов брожения и созревания; к сохранению в пиве нежелательных веществ, придающих ему букет молодого пива.

Из хорошо растворенного солода всегда получают сусло, содержащее достаточное количество аминокислот. Разумеется, если добавлять несоложенное сырье, сахар или сироп, то это не прибавляет в сусло аминокислот, и следует проводить аминокислотную паузу при 45 – 50 ^оС. Однако если применять хорошо растворенный солод, то ради образования низкомолекулярных продуктов расщепления белков не имеет смысла выдерживать паузу при 45 – 50 ^оС. В этом случае продолжительная пауза при 45 – 50 ^оС всегда дает в последующем плохую пену.

Метод формольного титрования

В молекуле аминокислоты имеются свободная аминогруппа, обладающая основными свойствами, и свободная карбоксильная группа, обладающая кислыми свойствами. В водном растворе основные свойства аминогруппы почти нейтрализуются кислыми свойствами карбоксильной группы, в результате чего реакция раствора близка к нейтральной. Сёренсен предложил связывать аминогруппу формальдегидом. Вследствие связывания аминная группа теряет свои основные свойства, а карбоксильная группа, наоборот, в полной мере проявляет свои кислотные свойства и может быть оттитрована щелочью:

Принимают, что количество карбоксильных групп равно количеству аминных групп, связанных формальдегидом. Однако такое предположение верно только для моноаминокарбоновых кислот.

Полная нейтрализация карбоксильных групп происходит лишь при рН 9 – 9,5, что соответствует ярко-красному окрашиванию фенолфталеина.

Для введения поправки на присутствие дикарбоновых аминокислот анализируемый раствор предварительно нейтрализуют щелочью до рН 7 по бромтимоловому синему.

Метод формольного титрования дает хорошие результаты только для прозрачных бесцветных или слабоокрашенных растворов. Мутные и темноокрашенные жидкости титруют электрометрически.

Аппаратура и реактивы. рН-метр; мерные колбы вместимостью 100 см³; пипетки вместимостью 20 и 5 см³; химические стаканы на 100 см³; формольная смесь (50 см³ формалина х. ч. смешивают с 1 см³ раствора фенолфталеина с массовой долей 1 % и титруют 0,1 моль/дм³ раствором гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания. Смесь пригодна в течение 2 – 3 дней); 0,1 моль/дм³ раствор гидроксида натрия.

Проведение анализа. В стакане взвешивают (25 ± 0,01) г мелассы и массу навески теплой дистиллированной водой, освобожденной кипячением от СО₂, переводят в мерную колбу вместимостью 100 см³. Раствор охлаждают до 20 ^оС, доводят до метки водой и перемешивают. В химический стакан отбирают пипеткой 20 см³ полученного раствора и титруют его 0,1 моль/дм³ раствором щелочи до рН = 7. Затем сюда же приливают из цилиндра 5 см³ формольной смеси и продолжают титрование до рН = 9,1.

Для контрольного титрования в химический стакан отмеривают 20 см³ дистиллированной воды и 5 см³ формольной смеси и также титруют до рН 9,1.

Содержание аминного азота X рассчитывают по уравнению

Х = 0,0014 (а — 6) · 100: Н, где а – объем 0,1 моль/дм³ раствора щелочи, пошедшей на титрование 20 см³ раствора мелассы, см³; б – то же, на титрование контрольной пробы, см³; Н — навеска мелассы, содержащаяся в 20 см³ раствора, г.

Пример. На анализ взято 25 г мелассы в мерную колбу вместимостью 100 см³. В 20 см³ раствора мелассы содержится 25: 100 · 20 = 5 мг мелассы. На титрование 20 см³ раствора мелассы пошло 11,2 см³ 0,1 моль/дм³ раствора щелочи, а контрольной пробы – 0,2 см³ той же щелочи. Содержание аминного азота в мелассе

X = 0,0014 · (11,2 – 0,2) · 100 : 5 = 0,31 %.