Йодометрический метод (по Попу и Стивенсу)

Метод основан на способности большинства аминокислот и пептидов образовывать с медью растворимые комплексные соединения («медный способ»). Избыток меди оттитровывают, а ее количество, эквивалентное аминному азоту, уксусной кислотой переводят в соль уксусной кислоты и количественно определяют йодометрическим титрованием.

Реактивы: раствор хлорной меди; раствор трехзамещенного фосфата натрия; боратный буферный раствор; суспензия фосфорнокислой меди (1 объем хлорной меди смешивают с 2 объемами раствора фосфата натрия и приливают 2 объема раствора боратного буфера; суспензию можно использовать в течение 2...3 сут); раствор тимолфталеина; 0,01 моль/дм³ раствор тиосульфата натрия (Na₂S₂CО₃); уксусная кислота с массовой долей 80 % (ледяная); раствор крахмала с массовой долей 1 % .

Проведение анализа аминного азота в солоде. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ прозрачного лабораторного солодового сусла, прибавляют 3...4 капли тимолфталеина и 1 моль/дм³ раствор гидрооксида натрия до бледно-голубого окрашивания. При перемешивании осторожно приливают 30 см³ суспензии фосфорнокислой меди и доводят до метки дистиллированной водой. Смесь после тщательного перемешивания фильтруют через бумажный фильтр, перефильтровывая первые порции фильтрата.

10 см³ прозрачного фильтрата подкисляют 0,5 см³ уксусной кислоты, прибавляют к нему 1 г йодистого калия и после размешивания оттитровывают выделившийся йод 0,01 моль/дм³ раствором тиосульфата натрия и добавляют в конце титрования 1...2 капли раствора крахмала. Титрование заканчивают при обесцвечивании раствора от одной капли тиосульфата натрия.

Количество пошедшего на титрование тиосульфата натрия, умноженное на 0,28, дает содержание аминного азота в 10 см³ фильтрата. Это соответствует 2 см³ сусла с учетом разбавления (исходя из того, что 1 см³ 0,01 моль/дм³ раствора тиосульфата соответствует 0,28 г азота).

Массу аминного азота N, мг в 100 см³ сусла, вычисляют по формуле

N = а · 0,28 · 5 · 10,

где а – объем 0,01 моль/дм³ раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование выделившегося йода, см³; 5 и 10 – коэффициенты пересчета с 2 см³ на 100 см³.

Пример. На титрование лабораторного сусла относительной плотностью 1,0357 (содержание СВ 8,951 % мас.) пошло 1,28 см³ тиосульфата натрия. Содержание аминного азота в 100 см³ сусла составляет

N = 1,28· 0,28· 5 ·10 = 17,92 мг.

В 100 г экстракта аминного азота

N₁ = 17,92 · 100 / (1,0357 · 8,951) = 193,3 мг.

Если солод перерастворен, то в 100 г экстракта будет содержаться более 230 мг аминного азота; если солод очень хорошо растворен – 230...200 мг; если хорошо растворен – 200... 180 мг; если плохо растворен – менее 180 мг.

В пересчете на 100 г СВ солода содержание аминного азота варьирует от 120 до 160 мг.

Метод гель-фильтрации растворов растительных белков

Гель-хроматография — метод разделения веществ, основанный на различии размеров их молекул. Метод известен под названиями «гель-проникающая», «эксклюзионная» и «молекулярно-ситовая хроматография». Последнее название наиболее полно отражает сущность метода, однако более распространен термин «гель-проникающая хроматография».

В качестве неподвижной фазы применяют гели, имеющие определенный размер пор; подвижной фазы — водные или органические элюенты. Наиболее простое объяснение механизма разделения в гель-хроматографии состоит в том, что молекулы анализируемых веществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и элюентом, протекающим через слой неподвижной фазы. Молекулы с размером, позволяющим проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, задерживаются в порах. Молекулы, имеющие размеры большие, чем поры, не проникают в сорбент и вымываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, проникающие в поры всех размеров, движутся наиболее медленно. Снижение скорости движения компонентов вдоль колонки прямо связано с количеством пор, в которые способны диффундировать распределяемые частицы.

Таким образом, методом гель-хроматографии можно разделять смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход компонентов из колонки происходит в порядке снижения их молекулярных масс. Вытекающие из колонки растворы анализируют различными методами, например спектрофотометрическим, фотометрическим, титриметрическим.

Наиболее широкое распространение среди носителей для гель-хроматографии белков получили сорбенты, приготовленные на основе декстрана (сефадексы, сефакрилы, молселекты), полиакриламида (биогели Р, акрилексы), агарозы (сефарозы, биогели А) и др. Набухая в воде, они образуют гели.

Номер в маркировке сефадекса означает его пористость. Выбор определенной марки сефадекса определяется молекулярной массой исследуемого белка (чем больше соответствие размеров молекул и величины пор, тем выше селективность), а степень зернения зависит от поставленной задачи. Для обессоливания растворов белков и их концентрирования обычно используют сефадексы G-25 и G-50 (грубый или средний). При разделении же смеси белков пользуются сефадексами тонкого или сверхтонкого зернения. Чем мельче частицы геля, тем эффективнее происходит разделение, но тем меньше скорость протекания раствора через колонку.

Гели готовят путем насыщения водой или элюентом в течение 5 – 20 ч соответствующего гелеобразователя (сефадекс, полиакриламид и др.). Продолжительность и температура насыщения указаны на упаковке препарата.

Проведение анализа. Колонку размерами 46,0´1,9 см заполняют сефадексом, обработанным 0,02 моль/дм³ универсальным буфером с рН 7,0. Наносят на нее 1,5 см³ раствора (7 мг/см³) белкового комплекса спиртовой дробины и элюируют тем же универсальным буфером (рН 7,0) со скоростью 12 см³/ч. Собирают фракции по 3 см³ и затем определяют в них содержание белка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм.

По окончании анализа колонку промывают несколькими объемами буферного раствора. Строят профиль элюирования отдельных белковых фракций. При этом на оси абсцисс откладывают номера пробирок (фракций) или объем, прошедшей через колонку жидкости, а на оси ординат - значения оптической плотности фракций. Белки, принадлежащие к одной фракции (пик на профиле элюирования), объединяют. О числе белковых фракций судят по количеству пиков на графике. Количественное определение белка ведут по градуировочному графику.

Построение градуировочного графика: Перед использованием подготовленной к работе колонки с сефадексом проводят ее калибрование, т. е. пропускают через нее смеси окрашенных компонентов - высокомолекулярных с коэффициентом разделения К = 0 и низкомолекулярных с К = 1.

В таблице приведены характеристики нескольких чистых (маркерных) белков с известной молекулярной массой (табл. 6). Калибровочную кривую строят, используя линейную зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюата V_е, вышедшего с колонки (рис. 7).

Таблица 6

Физико-химические характеристики маркерных белков

Наименование маркерных белков	Молекулярная масса (М), Да	Lg M	Объем элюции Vе, см^3
1. Лизоцим	13 930	4,143	54
2. Трипсин	25 700	4,409	48
3. Пероксидаза	34 000	4,531	45
4. Бычий альбумин	68 000	4,832	36
5. Голубой декстран	2 000 000	6,301	21